杨舒 ，张静，王思涵，范增，王静雪，韩毅，田宇，何丽娟，陈琳，岳文，李艳华，裴雪涛

1.广西医科大学，广西 南宁 530021；2.军事医学科学院 野战输血研究所干细胞与再生医学研究室，北京 100850；3.军事医学科学院 华南干细胞与再生医学研究中心，广东 广州 510005

造血干/祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs）是一群具有长期自我更新及定向分化成各系血细胞能力的细胞[1]。临床上，常采用造血干/祖细胞移植重建骨髓损伤患者的造血系统及免疫系统[2]。长期以来，造血干/祖细胞移植被用于治疗多种疾病，例如白血病等恶性血液病、重型再生障碍性贫血、自身免疫性疾病、急性放射病等[3]。

移植的造血干/祖细胞能否成功重建受者的造血及免疫系统取决于多方面的因素，如移植的造血干/祖细胞的数量、造血干/祖细胞的归巢效率、免疫排斥反应等[3-4]。目前，临床上主要采集外周血中的造血干/祖细胞作为移植细胞来源。在正常情况下，外周血中的造血干/祖细胞数量有限，为获得足够数量的造血干细胞，需要使用动员剂如粒细胞集落刺激因子（G-CSF）将骨髓中的造血干/祖细胞动员至外周血循环中[5]。我们新发现的小分子化合物Me6TREN（以下简称Me6）也具有将骨髓造血干/祖细胞动员至外周血的能力，有望成为一类新型的造血干/祖细胞动员剂候选药物[6]。近年来，脐带血造血干细胞移植在临床上的应用逐年增多[7-8]。但脐带血中的造血干/祖细胞数量较少，一份脐带血不能满足成年病人的治疗细胞量，因此需要对其进行扩增来获得足够数量的造血干/祖细胞[9]，目前已有研究团队开展体外扩增的造血干/祖细胞移植病人的临床试验[10]。优化造血干细胞扩增的培养体系，有助于进一步推动脐带血来源的造血干/祖细胞的临床应用。

Me6 是一类饱和胺类化合物，属于一类新型医药中间体，可用于制备远螯聚合物的原子转移自由基聚合（ATRP）配体。我们在前期工作中发现，单次皮下注射Me6 能将小鼠骨髓中的造血干/祖细胞快速有效地动员至外周血中[6]。传统的造血干/祖细胞动员剂G-CSF在动员造血干/祖细胞的同时，能促进造血干/祖细胞的扩增[11]，而化合物Me6 是否也能够促进造血干/祖细胞的扩增尚不明了。为此，我们检测了皮下注射Me6 的小鼠骨髓内造血干/祖细胞数量及比例的变化，并利用体外培养体系进一步考察了该化合物是否影响造血干/祖细胞的增殖。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性C57BL/6 小鼠，体重18～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证：SCXK-（京）2012-0001；饲养于军事医学科学院SPF级实验动物房。将雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组（Con组）和Me6组。检测前12 h，对Me6组C57BL/6小鼠皮下注射Me6，剂量为5 mg/kg；对照组注射PBS。

Me6TREN 购自Sigma 公司；红细胞裂解液购自BD公司；小鼠淋巴细胞分离液购自灏洋生物制品科技有限责任公司；流式抗体Lineage APC-Cy7（CD3，CD11b，Ter-119，B220，Ly-6G）、Sca-1 PE-Cy7、c-Kit Alexa Fluor 700 均购自eBioscience 公司；α-MEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；干细胞生长因子（SCF）、重组人血小板生成素（TPO）、白细胞介素3（IL-3）、白细胞介素6（IL-6）均购自Peprotech公司；半固体集落培养基M3434购自StemCell公司。

1.2 小鼠骨髓单个核细胞的分离培养

用颈椎脱臼法处死小鼠后，置于75%酒精中消毒，在无菌环境下分离小鼠股骨，用1 mL 注射器吸取培养液，将骨髓细胞冲出至离心管中，2000 r/min离心5 min，得到细胞沉淀，用5 mL PBS重悬细胞，加到等体积的淋巴细胞分离液上层，2000 r/min 离心20 min（离心机调至慢升慢降），收集中间层细胞，用PBS洗涤2次，得到单个核细胞。将细胞种于含有500 μL 培养基（α-MEM 培养基中加入10%胎牛血清，SCF 50 ng/mL，TPO 10 ng/mL，IL-3 10 ng/mL，IL-6 10 ng/mL）的24 孔低吸附板，放入37℃、5% CO2培养箱中培养。

1.3 小鼠骨髓造血干/祖细胞集落形成能力的检测

将小鼠半固体集落培养基（M3434）加入24孔低吸附板中，避免产生气泡，然后将细胞以5×103/孔的密度接种到24孔板，放入37℃、5% CO2培养箱中培养；7 d后，在显微镜下对形成的造血集落形成单位（colony-forming unit，CFU）进行计数；14 d 后，对高增殖潜能集落形成单位（high-proliferative-potential CFU，HPP-CFU）进行计数。

1.4 小鼠骨髓造血干/祖细胞表面标志的检测

将分离得到的小鼠骨髓细胞用红细胞裂解液处理后，取2×106细胞，用100 μL PBS 重悬至1.5 mL EP管中，加入抗体（Lineage、Sca-1、c-Kit），充分混匀后置于旋转混合器上，4℃避光孵育30 min，然后用PBS 洗涤细胞2 次，800 r/min 离心5 min，用300 μL PBS重悬细胞，转移至流式管中，用BD流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 小分子化合物Me6 对小鼠骨髓细胞集落形成能力的影响

C57BL/6 小鼠皮下注射Me6，剂量为5 mg/kg，12 h后分离小鼠骨髓单个核细胞，进行集落形成能力的检测。7 d后，对2组骨髓细胞的造血CFU进行计数比较，由结果（图1A）看出，与Con 组小鼠（87.67±4.096）相比，Me6 组小鼠（108.0±2.646）骨髓单个核细胞所形成的集落数显著增加（P=0.014）；14 d后，对HPP-CFU进行计数比较，由结果（图1B）看出，Me6组（18.75±1.109）小鼠HPP-CFU的数量较Con 组（14.33±0.667）也明显增加（P=0.0269）。这组结果表明Me6 能增加小鼠骨髓中造血祖细胞的数量。

2.2 小分子化合物Me6 对小鼠骨髓中造血干/祖细胞的比例及数量的影响

图1 Me6能增加小鼠骨髓中造血祖细胞的数量

将分离得到的Con组和Me6组小鼠骨髓单个核细胞进行流式细胞术分析，考察造血干/祖细胞的表面标志lin-Sca-1+c-Kit+（LSK）的表达情况。检测结果（图2）显示，与Con组（0.1412±0.01535）小鼠相比，Me6 组（0.2451±0.04030）小鼠骨髓中造血干/祖细胞的比例显著增加（P=0.0337）。

2.3 小分子化合物Me6 对体外培养的小鼠骨髓单个核细胞的影响

体外分离小鼠骨髓单个核细胞，在培养体系中添加小分子化合物Me6，培养4 d 后，对Con 组和Me6组细胞总数进行比较。结果（图3）显示，2组细胞的细胞总数没有显著差别（P=0.3769）。

2.4 小分子化合物Me6 对体外培养的小鼠骨髓单个核细胞的集落形成能力的影响

图2 Me6能增加小鼠骨髓中造血干/祖细胞的比例

图3 培养4 d的骨髓单个核细胞的数量

将在体外分离培养的小鼠骨髓单个核细胞分为Con组和Me6培养组，取培养4 d的细胞进行集落形成能力的检测。7 d后，对Con和Me6两组细胞的造血CFU 进行计数比较，由结果（图4A）看出，与Con组（81.75±3.568）相比，Me6 组（120.8±5.023）所形成的集落数增加（P=0.0007）；14 d 后，对HPP-CFU 进行计数比较，由结果（图4B）看出，Me6 组（19.67±1.202）HPP-CFU的数量较Con组（14.25±1.436）也明显增加（P=0.0406）。这组结果表明化合物Me6能增加体外培养的骨髓单个核细胞中造血祖细胞的数量。

2.5 小分子化合物Me6 对体外培养的小鼠骨髓单个核细胞中造血干/祖细胞增殖能力的影响

将在体外分离培养的小鼠骨髓单个核细胞分为Con 组和Me6 组，进行流式细胞术分析造血干/祖细胞（lin-Sca-1+c-Kit+）的增殖情况。检测结果（图5）显示，与Con 组（0.009625±0.001216）相比，Me6 组（0.01515±0.0007304）造血干/祖细胞中Ki-67的比例增加（P=0.0176）。这说明化合物Me6能促进体外培养的骨髓单个核细胞中造血干/祖细胞的增殖。

3 讨论

造血干/祖细胞是研究最为深入的成体干细胞，它具有自我更新以及分化成各系成熟血细胞的能力。在成体内，造血干/祖细胞主要定居于骨髓中。骨髓中的造血干/祖细胞不断地增殖分化形成各种血细胞，并和各种血细胞不断地在骨髓和外周血之间循环[1-2]。如今，造血干/祖细胞移植可以用来治疗多种血液疾病，但由于获得的造血干/祖细胞数量有限（如脐带血中的造血干/祖细胞数量较少），直接影响了移植的效率，因此需要对造血干/祖细胞进行扩增[4]。当前用于造血干/祖细胞扩增的方法很多，包括细胞因子、高通量筛选得到的小分子化合物、基质细胞等[7,12]。体外扩增使细胞脱离了体内的微环境，可能会增加细胞的凋亡；此外，扩增可以使细胞数量增多，但有可能增加的是成熟细胞而不是干细胞，扩增后造血干/祖细胞的长期植入能力可能并未得到提高[13]。因此，对造血干/祖细胞的扩增，需要的不仅仅是表型，还有功能性的提高，使其移植后能快速有效地重建患者的造血和免疫系统。

图4 培养4 d的骨髓单个核细胞中造血祖细胞的数量

图5 培养4 d的骨髓单个核细胞中造血干/祖细胞的Ki-67+比例

我们的前期研究表明Me6 具有很好的动员作用，能将骨髓中造血干/祖细胞动员至外周血中，增加外周血中造血干/祖细胞的比例及数量[6]。在本研究中，我们发现Me6还能促进小鼠骨髓造血干/祖细胞的增殖。对实验小鼠皮下注射Me6，12 h 后检测小鼠的骨髓，可发现骨髓细胞的集落形成能力增强，并且造血干/祖细胞的比例及数量也有所增加。这些结果提示该化合物在动员造血干/祖细胞的同时，可能促进了骨髓造血干/祖细胞的扩增。我们的芯片检测结果也提示化合物可能调节了Notch 信号通路，文献报道该通路具有促进造血干/祖细胞扩增的能力[14-16]。为进一步确定化合物Me6 是否具有体外促进造血干/祖细胞扩增的能力，我们在体外分离培养了小鼠骨髓单个核细胞，向培养体系中加入化合物Me6，培养4 d后Me6组细胞的集落形成能力及增殖的造血干/祖细胞的比例都增加了，这些结果提示Me6 具有体外促进造血干/祖细胞扩增的能力。对于小分子化合物Me6 是否能促进造血干/祖细胞的长期扩增及其可能的机制仍须进行深入的研究。

[1]Weissman IL.Stem cells:units of sevelopment,units of regeneration,and units in evolution[J].Cell,2000,100(1):157-168.

[2]Shizuru J A,Negrin R S,Weissman I L.Hematopoietic stem and progenitor cells:clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system[J].Annu Rev Med,2005,56(1):509-538.

[3]Schuster J A,Stupnikov M R,Ma G,et al.Expansion of hematopoietic stem cells for transplantation:current perspectives[J].Exp Hematol Oncol,2012,1:12.

[4]Andrade-Zaldívar H,Santos L,De León Rodríguez A.Expan-sion of human hematopoietic stem cells for transplantation:trends and perspectives[J].Cytotechnology,2008,56(3):151-160.

[5]Pelus L M.Neutrophil-derived MMP-9 mediates synergistic mobilization of hematopoietic stem and progenitor cells by the combination of G-CSF and the chemokines GRO/CXCL2 and GRO T/CXCL2 4[J].Blood,2004,103(1):110-119.

[6]Zhang J,Ren X,Shi W,et al.Small molecule Me6TREN mobilizes hematopoietic stem/progenitor cells by activating MMP-9 expression and disrupting SDF-1/CXCR4 axis[J].Blood,2014,123(3):428-441.

[7]Shpall E J,Quinones R,Giller R.Transplantation of ex vivo expanded cord blood[J].Biol Blood Marrow Transplant,2002,8(10):368-376.

[8]Hofmeister C C,Zhang J,Knight K L,et al.Ex vivo expansion of umbilical cord blood stem cells for transplantation:growing knowledge from the hematopoietic niche[J].Bone Marrow Transplant,2007,39(1):11-23.

[9]Ballen K K,Gluckman E,Broxmeyer H E.Umbilical cord blood transplantation:the first 25 years and beyond[J].Blood,2013,122(4):491-498.

[10]Wagner J E,Barker J N,DeFor T E,et al.Transplantation of unrelated donor umbilical cord blood in 102 patients with malignant and nonmalignant diseases:influence of CD34 cell dose and HLA disparity on treatment-related mortality and survival[J].Blood,2002,100(5):1611-1618.

[11]Hermans M H A.Signaling mechanisms coupled to tyrosines in the granulocyte colony-stimulating factor receptor orchestrate G-CSF-induced expansion of myeloid progenitor cells[J].Blood,2003,101(7):2584-2590.

[12]Sauvageau G,Iscove N N,Humphries R K.In vitro and in vivo expansion of hematopoietic stem cells[J].Oncogene,2004,23(43):7223-7232.

[13]Walasek M A,van Os R,de Haan G.Hematopoietic stem cell expansion:challenges and opportunities[J].Ann N Y Acad Sci,2012,1266:138-150.

[14]Chiba S.Concise review:Notch signaling in stem cell systems[J].Stem Cells,2006,24(11):2437-2447.

[15]Calvi L M,Adams G B,Weibrecht K W,et al.Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche[J].Nature,2003,425(6960):841-846.

[16]Weber J M,Forsythe S R,Christianson C A,et al.Parathyroid hormone stimulates expression of the Notch ligand Jagged1 in osteoblastic cells[J].Bone,2006,39(3):485-493.