徐俊鸿 高卓维 黄景彬 仇志坤 伍志勇

（广州中医药大学附属顺德中医院（佛山市顺德区中医院）· 佛山 528333）

1 材料和方法

1.1 细胞株与试剂

人鼻咽癌细胞CNE-1(由中国科学院提供），细胞培养试剂：胎牛血清（Hyclone，Cat.No.SH30087.01），RPMI-1640 培养基（Hyclone，Cat.No.SH30809.01B），青链霉素（Hyclone，Cat.No. H30010），PBS 磷酸钾缓冲液（Hyclone，Cat.No.SH30256.01B）

1.2 实验用药与仪器实验用药与仪器：实验用药：龙葵鲜药由顺德中医院提供。龙葵鲜药水煎提取液(1g/ml)的制备：取鲜龙葵500g,加水1000m1煎煮，得第一次提取液约500ml;再将其药渣用水700ml煎煮，得第二次提取液约500ml。两次提取液混合，过滤，滤液再加热浓缩至500ml，即得。龙葵鲜药水煎提取液由顺德中医院制剂室制备。仪器：苏州安泰洁净工作台（SWCJ-IFD），低速离心机（中佳，SC3614），倒置光学显微镜（OLYMPUS CKX41, U-CTR30-2）, 细胞恒温培养箱(Thermo scientific, HERACELL150i) 倒置荧光显微镜生产商：Leica型号：DMI6000B

1.3 实验方法

1.3.1 药物配制及分组 药物过滤除菌，药液配成浓度为1g／ml于-20℃保存，实验时取出用新鲜培养基配成相应的浓度进行给药。实验分组：按龙葵鲜药水煎液浓度分为5mg/ml组、10mg/ml组、30mg/ml组、50mg/ml组和80mg/ml组，对照组不加药。

1.3.2 CNE-1细胞培养 复苏CNE-1细胞。将其用RPMI-1640培养液(含10%胎牛血清青霉素、链霉素100U／ml)于37℃，5%C02饱和湿度培养条件下培养，每隔2～3天换一次液。置倒置显微镜下观察，待细胞取汇合率达80%～90%时，

用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化，按1:2～3传代培养或者进行实验。

1.3.3 MTS法检测细胞增殖 取对数生长期细胞，经消化后吹打散细胞，计数，调整细胞浓度为1×105 个/ml，分到96孔板，每孔100ul，即每孔细胞为1×104个，每个浓度组（5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml）和对照组均做3个复孔。贴壁细胞需待细胞贴壁后，再收集各时间点细胞进行检测。收集各个时间点的细胞（24h，48h，72h）加入cellTiter96AQ 单溶液细胞增殖检测试剂（Promega，Cat.No.G3582），比例为1/10（即100ul培养液加入10ul 检测液）。……