吴华慧 李 姝 潘柳谷 黄燕军

（广西医科大学药学院，广西 南宁 530021）

匙羹藤总皂苷抗氧化活性研究

吴华慧 李 姝 潘柳谷 黄燕军

（广西医科大学药学院，广西 南宁 530021）

目的：研究匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、和脂质过氧化物（LPO）作用的影响。方法：通过硫代巴比妥酸（TBA）分光光度法测定大鼠肝脏脂质过氧化(LPO)的二级分解产物丙二醛(MDA)的含量，以考察匙羹藤总皂苷对实验大鼠肝脏LPO的作用影响，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力，钼酸铵显色法测定CAT的活力，考察匙羹藤总皂苷对实验大鼠肝脏SOD和CAT的作用大小。结果：与对照组比较匙羹藤总皂苷在1.0mg/ml～6.0mg/ml浓度范围可抑制大鼠肝脏LPO作用；在1.0mg/ml～6.5mg/ml浓度范围内可提高大鼠肝脏SOD和CAT的活性。结论：匙羹藤总皂苷可以提高大鼠肝脏SOD和CAT的活性，降低MDA的产生。

超氧化物歧化酶（SOD）；过氧化氢酶（CAT）；脂质过氧化物（LPO）；匙羹藤

抗衰老生物学和自由基生物学是近年来生命科学的研究热点，研究和开发新型抗氧化功能食品和天然抗氧化剂能满足人们对健康长寿日益增长的要求，根据衰老的自由基理论，研究抗衰老植物的报告颇多，其研究途径大致有三大类：一是，研究抗衰老植物有无直接清除自由基的作用；二是，研究抗衰老植物能否提高机体内抗氧化酶的活性，以达到间接清除自由基的目的；三是，研究抗衰老植物是否具有抑制脂质过氧化物及代谢废物的作用。本实验研究的匙羹藤总皂苷，在国内外的报道大多是对小鼠细胞的某些免疫学效应、药理作用及临床应用上的研究[1-3]，而对其抗氧化活性的生物化学研究方法少见报道。本研究匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏线粒体LPO作用的影响，以及对大鼠肝脏线粒体SOD、CAT 活性的影响。笔者采用大鼠肝脏组织匀浆进行实验测定的方法，了解匙羹藤总皂苷对实验大鼠肝脏SOD、CAT、LPO作用的影响。

1 材料与方法

1.1试剂和主要仪器

FJ-200高速分散匀质机（上海标本模型厂）；3k15台式高速冷冻离心机（SIGM公司）；数显式三用电热恒温水温箱；电子天平；722型分光光度计；超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、过氧化氢酶（CAT）测试盒、蛋白定量测试盒(上述测试盒均为南京建成生物工程研究所制)、硫代巴比妥酸；冰醋酸；L—半胱氨酸；2-硫代巴比妥酸（TBA）；1,1,3,3-四乙氧基丙烷（TEP）；SD大鼠,体重180-220g（雌性各半），由广西医科大学实验动物中心提供(动物生产许可证SCSK桂2014-0003)；试验用水为自制双蒸水。

1.2方法

1.2.1肝匀浆的制备

①匀浆介质的制备：将 Tris1.21g及 EDTA-2Na37.23mg加双蒸水500ml,再用200mmol/LHCL进行滴定至pH7.4,然后加入3.42g蔗糖，8gNaCL,用双蒸水稀释到1000 ml，放入盐水瓶中，以9磅压力进行消毒30min，4℃冰箱中备用。

②取SD(体重180g～220g)大鼠，禁食一天，颈椎脱臼处死，取肝脏，立即用冰冷的生理盐水漂洗，除去血液，滤纸吸干，称重，剪刀剪碎，用预冷的匀浆介质稀释成 20%肝匀浆，高速分散匀质机匀浆，之后置高速冷凝离心机中3000r/min离心15min，取上清液，用含糖PBS稀释配制成10%肝匀浆。用考马斯亮蓝法测定其蛋白含量[4]。

1.2.2匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏LPO的影响

在1.0mL的4g/L肝反应液中依次加入0.05mL硫酸亚铁、0.02mL L-半胱氨酸、不同浓度的匙羹藤总皂苷样品，混匀，37℃水浴 15min,再加入 2.0mL醋酸终止反应，最后加入2.0mLTBA，混匀，沸水中加热15min，流水冷却，在532nm处测吸光度值。

1.2.3匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏SOD的影响

采用试剂盒黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力。

表1　SOD活力测定操作表

混匀，室温静置10min，1cm光径，双蒸水调零，550nm处测吸光度值。

组织匀浆中SOD活力计算公式：

SOD活力（U/mgprot）=（对照OD值-测定OD值）∕对照 OD值÷50%×稀释倍数÷待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)

1.2.4匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏CAT的影响

采用试剂盒钼酸铵显色法测定CAT的活力。

表2　CAT活力测定操作表

混匀，0.5cm光径，405nm处，双蒸水调零，测吸光度值。

组织匀浆中CAT活力计算公式：

CAT活力（U/mgprot）=（对照OD值-测定OD值）×271 ×（1/60×取样量）÷待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)

1.2.5数据处理

采用统计学软件SPSS13.0进行分析，结果以均数±标准差（±s）表示。组间分析采用One-Way ANOVA和SNK-q两两比较得到相应P值。以P<0.05或P<0.01差异显著，有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1不同剂量匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏LPO影响

结果由表3可见，除雌性大鼠样品组7和雄性大鼠样品组5与对照组比较无显著性差异外，其余各组肝脏LPO值均低于对照组(P<0.05)。说明匙羹藤总皂苷在 1.0mg/ml～6.0mg/ml浓度范围可以抑制大鼠肝脏脂质过氧化。

表3　总皂苷对大鼠肝脏LPO的影响（n=4，±s）

表3　总皂苷对大鼠肝脏LPO的影响（n=4，±s）

注：样品组与对照组比较，经t检验，除*组的P>0.05外，其余各组P＜0.05。

组别 　总皂苷(mg) 　雌 　雄 　雌 　雄对照组　0 .00 　2.230±0.01　2.905±0.01 LPO含量(umol/g.蛋白) 　抑制率(%)样品组1 　1.00 　1.945±0.02　2.519±0.02 　12.78 　13.29 2 　2.00 　1.955±0.03　2.596±0.01 　12.33 　10.64 3 　3.00 　1.900±0.01　2.110±0.03 　14.80 　27.37 4 　4.00 　1.756±0.03　2.098±0.04 　21.26 　27.78 5 　4.50 　1.652±0.06　2.084±0.08 　25.92 　28.26*6 　5.50 　1.632±0.05　1.986±0.00 　26.82 　31.64 7 　6.00 　1.643±0.02　1.985±0.02 　26.32*　31.67

2.2不同剂量匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏SOD的影响

结果见表4，匙羹藤总皂苷加入量在1.00～6.50mg之间，与对照组比较SOD活性明显提高，说明匙羹藤总皂苷可以提高大鼠肝脏线粒体SOD的活性。

表4　总皂苷对大鼠肝脏SOD活性的影响（n=4，±s）

表4　总皂苷对大鼠肝脏SOD活性的影响（n=4，±s）

注：与对照组比较经t经验，样品组各点p<0.05

组别 　总皂苷(mg) 　雌 　雄 　雌 　雄对照组　0 　2.43±0.01 　3.57±0.01 SOD活力（U/mgprot） 　提高率(%)样品组1 　1.00 　2.89±0.03 　3.83±0.01 　18.93 　7.28 2 　2.00 　2.88±0.07 　3.81±0.13 　18.52 　6.72 3 　3.00 　2.91±0.06 　3.96±0.21 　19.75 　10.92 4 　4.00 　2.91±0.02 　4.05±0.26 　19.75 　13.45 5 　5.00 　3.15±0.20 　4.29±0.20 　29.63 　20.17 6 　5.50 　3.22±0.08 　4.89±0.11 　32.51 　36.97 7 　6.00 　3.46±0.01 　4.98±0.01 　42.39 　39.50 8 　6.50 　3.43±0.07 　5.08±0.02 　41.15 　42.30

2.3不同剂量匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏CAT的影响

结果见表5，匙羹藤总皂苷加入量在之间，与对照组比较CAT活性明显提高，说明匙羹藤总皂苷可以提高大鼠肝脏线粒体CAT的活性。

表5　总皂苷对大鼠肝脏CAT活性的影响（n=4，±s）

表5　总皂苷对大鼠肝脏CAT活性的影响（n=4，±s）

注：与对照组比较经t经验，样品组各点p<0.05

组别 　总皂苷(mg) 　雌 　雄 　雌 　雄对照组　0 　10.21±0.01　10.59±0.01 CAT活力（U/mgprot） 　提高率(%)样品组1 　1.00 　10.82±0.03　11.02±0.01 　5.97 　4.06 2 　2.00 　11.06±0.07　11.89±0.13 　8.33 　12.27 3 　3.00 　12.19±0.06　12.02±0.21 　19.39 　13.50 4 　4.00 　12.35±0.02　12.56±0.26 　20.96 　18.60 5 　4.50 　13.25±0.20　12.94±0.20 　29.77 　22.19 6 　5.50 　13.78±0.08　13.59±0.11 　34.97 　28.33 7 　6.00 　14.20±0.01　13.97±0.01 　39.08 　31.92 8 　6.50 　14.58±0.07　14.28±0.02 　42.80 　34.84

2.4讨论

研究大鼠肝脏LPO、SOD、CAT已经有一套较成熟的实验方法，通过加入匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏线粒体作用模型的影响，用细胞匀浆硫代巴比妥酸(Thiobarituric acid, TBA)比色，测定大鼠肝脏线粒体LPO的含量，说明匙羹藤总皂苷在1.00～6.00mg范围内具有抑制LPO及其代谢废物的作用；采用试剂盒黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力，测定体系中加入匙羹藤总皂苷（1.00～6.50mg/ml），可提高大鼠肝脏线粒体SOD的活性，采用试剂盒钼酸铵显色法测定CAT的活力，测定体系中加入匙羹藤总皂苷（1.00～6.50mg/ml），提高了大鼠肝脏线粒体CAT的活性，说明匙羹藤总皂苷能提高机体内抗氧化酶的活性，以达到间接清除自由基之目的。通过匙羹藤对大鼠肝脏细胞抗氧化能力指标LPO、SOD、CAT的影响的研究，预测其对人体抗氧化作用的功效,为其做为功能性食品添加剂的开发利用提供科学依据及开发前景。

[1] 李茜.广西几种特色壮药的药理毒性及活性成分的研究进展[J].中医药学刊,2005,23(12):2232-2233.

[2] 甄汉深,梁洁,周芳.广西匙羹藤茎 95%乙醇提取物降血糖作用及其机制的初步研究[J].中国实验方剂学杂志,2007, 13(1):32-34.

[3] 扈玉华,路建荣,朱习会.匙羹藤提取物体外抑菌活性的观察[J].中国中医药信息杂志,2008,15(10):40-41.

[4] 吴耀生.新编生物化学实验[M].北京:人民卫生出版社, 2002:120-145.

Study on antioxidant activity of total saponins of gymnema sylvestre

Objective: the effect of total saponins of Gymnema sylvestre on rat liver superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and lipid peroxide (LPO) effect. Methods: by thiobarbituric acid (TBA) spectrophotometric method determination of rat liver lipid peroxidation (LPO) secondary decomposition product malondialdehyde (MDA) content, in order to examine the effect of total saponins of Gymnema sylvestre on experimental rat liver LPO effect by xanthine oxidase method determination of the activity of superoxide dismutase (SOD), ammonium molybdate significantly colorimetric determination of CAT activity. The effect of the size of the total saponins of Gymnema sylvestre the role of experimental rat liver SOD and cat. Results: with the control group comparison of total saponins of Gymnema sylvestre in 1.0mg/ml-6.0mg/ml concentration range can inhibit rat liver lipid peroxidation; can improve the activity of SOD and cat in rat liver in 1.0mg/ml-6..5mg/ml concentration within the scope of. Conclusion: the total saponins of Gymnema sylvestre can improve SOD and CAT activity in rat liver, reduce the production of MDA.

Superoxide dismutase (SOD); catalase (CAT); lipid peroxide (LPO); gymnemasylvestre

R93

A

1008-1151(2015)11-0057-02

2015-10-11

广西自然科学基金项目“广西特色中草药匙羹藤总皂苷提取工艺及生物活性研究”（2012GXNSFAA239001）。

吴华慧（1973－），女，广西医科大学药学院讲师，硕士，从事天然产物活性研究及医药化学教学工作。

李姝（1968－），女（壮族），广西医科大学药学院研究员，硕士，从事天然植物提取和抗氧化活性的研究。