李晓毓，吴兰平，王凤英

（黄山学院 生命与环境科学学院，安徽 黄山245041）

黄山花楸 (Sorbus amabilis) 隶属蔷薇科(Rosaceae)花楸属(SorbusL.)落叶乔木,兼具观赏、药用、经济价值的第三纪古老孑遗树种。黄山花楸自然繁殖能力弱，天然更新能力差，分布范围和数量日益减少，现我国仅分布于华东地区的皖南以及浙、鄂、闽等省700-1500m 中山地带以及1500m 以上的高山地带，已处于濒危境地, 被国家列为三级珍稀濒危保护植物[1]。

为保护这一珍稀物种的种质资源和进一步对其开发利用, 前人通过组织培养在花楸属其他种进行了一些探索和研究，及华等[2]以黑果腺肋花楸的茎尖、茎段为材料摸索出了不定芽诱导、增殖培养、生根培养、驯化及移栽的适宜条件；安洁等[3]以石灰花楸带芽茎段为试验材料, 研究了适宜石灰花楸的芽启动培养基、最佳继代培养基和生根培养基。有关黄山花楸的组织培养及快速繁殖研究至今仍为空白。本实验研究了基本培养基、植物激素因素对黄山花楸愈伤组织的诱导的影响, 为建立黄山花楸组织快繁体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 外植体的选取和处理

黄山花楸果实于10月下旬采自安徽省黄山风景区天海景区(海拔1700-1800m)，选择生长健壮、无病虫害的母株进行采种。采摘下来的黄山花楸果实在水中浸泡后搓洗，去掉果皮和果肉，多次冲洗去杂得到纯净种子,室温自然干燥，剔除杂质和空粒,挑选出饱满种子，置于4℃冰箱黑暗处理24h 待用。

1.2 外植体的灭菌和接种

低温干藏处理后的花楸种子用75%的酒精消毒20 秒，用无菌水冲洗3 次，再用0.05%升汞对种子灭菌3 分钟，无菌水冲洗6 次，之后将种子放在垫有滤纸的培养皿中，在种子子叶端用手术刀切割一个0.5cm 左右的小口，从切口处小心将种胚挤出，将剥离好的白色饱满种胚接种于MS 基本培养基上。

1.3 愈伤组织的诱导

本实验所用培养基MS 基础培养基，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，PH5.8-6.0。添加不同激素组合分别进行诱愈，激素组合如下：第一组：MS+NAA(0.1，0.2，0.3mg/L)； 第二组：MS+6-BA(1，2，3mg/L)；第三组 ：MS +NAA (0.1，0.2，0.3mg/L） +6 -BA(1，2，3mg/L)。

1.4 培养条件

将接种在MS 培养基的成熟合子胚避光处理72h，之后光照16h，黑暗8h,光照强度为2000lx 左右,温度为(22±2)℃，湿度约70-80%。接种在添加不同激素的愈伤诱导培养基上的成熟合子胚，培养条件同上。

1.5 观察与统计方法

成熟合子胚在MS 培养基上培养5 天统计萌发率，合子胚的子叶接种至不同的诱导培养基培养20天后，统计出愈率：

萌发率（%）=（萌发数）/接种的种胚数

出愈率（%）=（产生愈伤组织的种胚数）/接种的种胚数

2 结果与分析

2.1 种皮对花楸种子萌发的影响

黄山花楸果实为球形小梨果,果皮光滑，种子长卵形,背面隆起,种皮黄褐色,长度2.30-3.10mm,平均长2.80mm,宽1.32-1.80mm,平均宽1.50mm。成熟种子由种皮和胚两部分组成，解剖镜下观察黄山花楸种胚形态发育完全,成熟胚具有两片肥厚的子叶、圆柱形胚根，胚芽、胚轴等不明显。

成熟合子胚在MS 培养基上培养5d 后两片子叶展开，胚轴伸长弯曲，8d 左右长出真叶，20d 后长成单株无菌苗。对照完整种子30d 无萌发现象，证明胚本身不存在休眠，且萌发能力很强，子叶中不存在明显的萌发抑制物质，种子休眠主要是由于胚外环境——种皮造成的。

2.2 激素浓度对成熟合子胚愈伤组织诱导的影响

成熟合子胚分别接种于第一、二、三组诱导培养基上。接种5d 后, 可明显看到胚明显膨大变厚，15d 后,合子胚的子叶和下胚轴均开始愈伤化，出现淡绿色或淡黄色的愈伤组织，上面布满细小颗粒状突起，分布紧凑。不同激素配比的培养基都可以诱导愈伤组织，但愈伤组织出愈率存在差别，见表1。

表1 不同激素组合对黄山花楸愈伤诱导的影响

观察统计发现:6-BA 为1.0mg/L，NAA 为0.1mg/L 时，愈伤组织的诱导率达100%，优于其他组合，推测6-BA 和NAA 共同诱导愈伤组织。随着NAA 浓度的增高, 合子胚愈伤出愈率下降，推测低浓度的NAA 对黄山花楸愈伤诱导有促进作用。

3 结 论

1.黄山花楸休眠主要是由于种皮机械障碍造成的物理休眠，去掉种皮后可以生成完整的无菌苗。种子休眠归纳为种皮束缚性休眠和种胚性休眠，其中种皮束缚性休眠种子的种胚取出后，就不再休眠[4]。黄山花楸未处理的完整种子不能萌发, 去掉种皮将种胚剥离出来后可以萌发，并长成完整的无菌植株，表明黄山花楸种子休眠主要是由于种皮机械障碍造成的物理休眠。休眠解除应选择针对种皮而非种胚的处理方式，如种皮酸碱腐蚀、热水浸种、机械划伤、混沙层积等方法[5,6]来进行打破休眠的研究。

2.黄山花楸成熟合子胚在添加不同激素组合的愈伤诱导培养基上均可诱导愈伤组织，激素浓度不同，愈伤诱导率存在差异，最佳诱愈培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L。实验发现，成熟合子胚的愈伤组织诱导相对比较容易，这为今后开展黄山花楸成熟合子胚体细胞胚胎发生以及植株再生等方面的探索奠定了良好基础，但是在培养过程中如何控制愈伤组织的分化和不定芽的增殖以得到质好量大的芽，并且保证植株成苗率高等研究还需逐步开展。

[1]洪岚.珍贵的高山观赏树种—黄山花楸[J].植物杂志,2002(1):18-18.

[2]及华,张红梅,张海新.黑果腺肋花楸的组织培养和快速繁殖[J].植物学通讯,2004,40（1）:67-67.

[3]安洁.石灰花楸的组织培养技术体系研究[D].成都：四川农业大学，2004:49.

[4]Bewley J D.种子的发芽和休眠[J].种子,2002(6):84-86.

[5]陈昕,曹珊珊,张红星.黄山花楸种子休眠影响因素[J].东北林业大学学报,2010,38（7）:5-7.

[6]鱼小军,王芳,龙瑞军.破除种子休眠方法研究进展[J].种子,2005,24(7):46-49.