王立强，雷春花，邱飞，杨会勇

（华侨大学 生物医学学院，福建 泉州362021）

随着分子医学和分子生物学的发展，抗癌药物的研究已从传统的、非特异的细胞毒药物向作用于多信号传导分子、多环节的选择性靶向抗癌药物发展［1－2］.在各种分子靶点中，蛋白酪氨酸激酶是目前国际上抗肿瘤药物研发的热点［3］.本课题组针对现有酪氨酸激酶抑制剂的空间结构特点［4－5］，整合计算机辅助药物设计手段，以及生物电子等排、骨架迁越原理设计合成了一系列结构新颖的活性喹啉类萘甲酰胺衍生物，以期发现具有更高抗癌活性、更低毒性和更高生物利用度的小分子靶向药物.经前期体外活性验证及结构优化，从中筛选出候选化合物TW918（a），化学名称为N－（2－苯胺基）－6－（7－氯喹啉－4－醚氧基）－2－萘酰胺，分子式为C26H18ClN3O2，相对分子质量为439.本文主要对TW918的合成方法、体外抗肿瘤活性、与EGFR 蛋白的结合性及抑制作用进行研究.

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

4，7－二氯喹啉、6－羟基－2－萘甲酸和邻苯二胺（百灵威科技有限公司）；其他合成试剂（国药集团化学试剂公司）；人小细胞肺癌NCI－H446、人非小细胞肺癌A549、人食管癌Eca－109、人肝癌HepG2、正常人脐静脉内皮细胞HUVEC和正常人胚肺成纤维细胞MRC－5（上海中科院细胞库）；正常人肝细胞LO2和正常人食管上皮细胞HEEC（ATCC）；RPMI－1640、MEM、F－12K 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（美国Gibco公司）；二甲基亚砜（DMSO）、四氮唑盐（MTT）（美国Sigma公司）；兔抗人EGFR 抗体、兔抗人Actin抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（美国Abcam 公司）；超敏ECL化学发光试剂盒（碧云天物技术研究所）；吉非替尼对照品（大连美仑生物技术有限公司）；THF（四氢呋喃）和DCM（二氯甲烷）经分子筛干燥后直接使用；其他溶剂未特别指出则未经处理.

TLC硅胶板和柱层析硅胶（青岛海洋化工厂）；96孔细胞培养板（美国Coring公司）；Q Exactive型高分辨质谱仪（美国Thermo公司）；AV400型核磁共振（德国Bruker公司）；WRR 熔点仪（上海精密科学仪器有限公司）；CO2培养箱（美国Thermo公司）；Infinite M200型全功能酶仪（瑞士Tecan公司）；HJ－4型四联磁力搅拌机（江苏金坛市天竟实验仪器厂）；BS224S 型电子天平（德国Sartorius公司）；Forma－86℃超低温冰箱（美国Thermo公司）；ChemiDoc XRS型凝胶成像系统、Mini－PROTEAN Tetra C型垂直板电泳和转膜装置（Bio－Rad公司）.

1.2 TW918的合成方法

目标化合物TW918的合成路线，如图1所示.

图1 TW918的合成路线Fig.1 Synthesis route of TW918

1.2.1 6－羟基－2－萘甲酸乙酯（1）的合成 称取1.88g（10mmol）6－羟基－2－萘甲酸溶于50mL 无水乙醇，搅拌下加入4滴浓硫酸，78～85 ℃加热回流4～5h.TLC 监测反应结束后，将反应液冷却，减压除去溶剂，残留物用10mL乙酸乙酯溶解.饱和碳酸氢钠萃取3次，每次10mL，收集有机相加入无水硫酸钠静置干燥，30min后减压除去溶剂，得到棕色固体（1）1.99g，产率为92%.1H－NMR（400 MHz，DMSO），δ值：8.56（d，J＝8.62 Hz，1H），8.02（dd，J＝8.61 Hz，1.88 Hz，1H），7.86（d，J＝8.46 Hz，1H），7.69（d，J＝8.50Hz，1H），7.22（s，1H），7.19（dd，J＝8.72Hz，2.42Hz，1H），6.11（s，1H），4.48（q，J＝7.01 Hz，2H），1.47（t，J＝7.05 Hz，3H）.13C－NMR（400 MHz，DMSO），δ值：17.56，60.05，125.02，127.04，127.13，129.16，130.42，130.64，131.62，132.04，138.39，142.37，163.72.

1.2.2 6－（7－氯喹啉－4－醚氧基）－2－萘甲酸乙酯（2）的合成 称取2.16g（10mmol）6－羟基－2－萘甲酸乙酯溶于50mL N，N－二甲基甲酰胺（DMF）.冰浴搅拌下，缓慢滴加含有0.48g（20mmol）氢化钠（NaH）的DMF溶液5mL，冰浴搅拌30min，撤去冰浴.待温度恢复至室温，缓慢滴入含有1.97g（10mmol）4，7－二氯喹啉以及0.33g（2mmol）碘化钾（KI）的DMF溶液10mL，室温搅拌30min，110 ℃下反应6～10 h.TLC监测反应结束后，减压除去溶剂，加入15mL甲醇超声溶解，重复洗涤3次，真空干燥，得白色固体（2）3.20g，产率为85%.1H－NMR（400MHz，DMSO），δ值：8.76（d，J＝9.02Hz，1H），8.73（dd，J＝8.74Hz，2.13Hz，1H），8.36（d，J＝8.54Hz，1H），8.14（d，J＝8.62Hz，1H），8.04（s，1H），7.92（dd，J＝8.80Hz，2.56Hz，1H），7.73（d，J＝7.04 Hz，1H），7.62（dd，J＝7.24 Hz，1.86 Hz，1H），6.82（s，1H），8.06（d，J＝7.80Hz，1H），6.84（d，J＝8.54Hz，1H），4.40（q，J＝7.14Hz，2H），1.39（t，J＝7.21 Hz，3H）.13C－NMR（400 MHz，DMSO），δ值：18.72，60.63，109.24，116.07，119.68，122.50，124.21，126.47，126.65，127.73，128.74，128.90，130.24，131.18，132.41，135.61，139.76，140.83，151.02，156.20，161.08，164.46.

1.2.3 N－（2－苯胺基）－6－（7－氯喹啉－4－醚氧基）－2－萘甲酰胺（TW918）的合成 称取6－（7－氯代喹啉－4－醚氧基）－2－萘甲酸乙酯3.78g（10mmol）溶于10mL乙醇.冰浴搅拌下，缓慢滴加含有1.56g（20mmol）乙醇钠（NaOEt）的乙醇溶液5mL，冰浴搅拌30min，撤去冰浴.待温度恢复至室温，缓慢滴入含有1.08 g（10mmol）邻苯二胺的乙醇溶液10mL，搅拌30min，78～85 ℃下反应6～10h.TLC 监测反应完全后，将反应液用饱和碳酸氢钠和食盐水分别萃取3次，每次15mL.收集有机相无水硫酸钠干燥30min，减压除去溶剂，再将固体与适量硅胶搅拌均匀，以体积比为3∶1的石油醚∶乙酸乙酯为洗脱剂进行硅胶柱层析分离得到白色固体（TW918）3.70g，产率为83%，熔点为165.7～166.4 ℃.1H－NMR（400 MHz，DMSO），δ值：9.88（s，1H），8.76（d，J＝5.27 Hz，1H），8.46（d，J＝9.29 Hz，1H），8.42（d，J＝9.03Hz，1H），8.14（d，J＝2.01Hz，1H），8.10（d，J＝8.28Hz，1H），7.97（d，J＝2.50 Hz，1H），7.91（d，J＝6.78Hz，1H），7.73（dd，J＝9.03Hz，2.26Hz，1H），7.68（t，J＝15.31Hz，8.03Hz，1H），7.62（dd，J＝2.51Hz，9.29Hz，1H），7.37（brt，J＝8.03Hz，6.78Hz，1H），7.01（t，J＝13.80Hz，6.53Hz，1H），6.83（d，J＝9.03Hz，1H），6.77（d，J＝5.27Hz，1H），6.65（t，J＝14.81 Hz，7.78 Hz，1H），5.00（s，2H）.13C－NMR（400 MHz，DMSO），δ值：110.88，113.01，116.20，116.40，121.11，121.43，121.82，121.96，124.09，124.65，125.25，125.64，125.97，127.30，128.50，128.78，133.27，134.23，134.62，136.63，141.52，142.99，151.27，156.41，157.04，163.29.HR－MS（＋），m／z为440.884 6（［M＋H］＋，C26H18ClN3O2H＋calcd：440.884 9）.

1.3 细胞培养

NCI－H446，Eca－109，LO2 和HEEC 细 胞 单 层 接 种 于 含10%胎 牛 血 清 的RPMI－1640 培 养 基；HepG2和MRC－5细胞单层接种于含10%胎牛血清的MEM 培养基；A549和HUVEC 细胞单层接种于含10%胎牛血清的F－12K 培养基中，分别置于37 ℃，5%二氧化碳培养箱中培养.

1.4 MTT法测定TW918对肿瘤细胞的抑制活性

取对数生长期的NCI－H446，A549，Eca－109，HepG2，HUVEC，LO2，MRC－5和HEEC 细胞用体积浓度为0.25%的胰酶消化，制成1×104mL－1悬液接种于96孔培养板中，每孔100μL.细胞完全贴壁后，分别给予不同浓度的TW918，每组3 个复孔，阳性对照组为吉非替尼（Gefinitib），阴性对照组为DMSO.分别孵育72h后，每孔加入5mg·mL－1的MTT 20μL，继续培养4h，吸弃培养液，加入150 μL DMSO，振荡10min使结晶物充分溶解，用酶标仪在570nm 处测定各孔的吸光值值，采用SPSS 17.0软件计算半数抑制浓度（IC50）.重复测试3次，取平均值为最终结果.

1.5 分子对接软件考察TW918与受体激酶EGFR的亲和力

运用AutoDock 4.2.5软件将TW918与受体激酶EGFR 进行分子对接，计算TW918 与EGFR（PDB ID∶4HJO）靶蛋白的自由结合能，模拟在自由结合能最低的情况下化合物与EGFR 蛋白结合的空间构象，探讨其与受体间的亲合力，确定活性腔内与配体结合的关键残基［8］.

1.6 Western Blot检测受体激酶EGFR 蛋白的表达

将NCI－H446，A549，Eca－109和HepG－2细胞以5×105个·孔－1的密度接种于96孔板中.细胞完全贴壁后，分别给予不同浓度的化合物（2，4，8μmol·L－1的TW918，DMSO 含量为0.1%），阴性对照组给予同体积的DMSO.给药48h后吸弃培养基，用预冷的1×PBS洗涤细胞2次，每孔加入150μL Western及IP细胞裂解液，冰浴裂解30 min，1 000r·min－1离心5 min，收集上清液，以12%SDSPAGE凝胶电泳分离蛋白质.电泳后，将蛋白转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后，一抗4 ℃封闭过夜，再以辣根过氧化物酶标记的的二抗室温封闭2h，ECL 显色液显色1～2min，转移到荧光成像仪内曝光、检测，实验重复3次.

2 结果与讨论

2.1 TW918的合成

合成的小分子化合物TW918是一种新的喹啉类萘甲酰胺衍生物.合成反应中，首先利用无水乙醇保护6－羟基－2－萘甲酸的羧酸基团；然后，将其与4，7－二氯喹啉进行亲核取代，再胺解得到TW918，其产率为64.9%.此法操作简便，原料便宜易得，反应效率高，易于进行工业化生产.

2.2 TW918的体外抗肿瘤活性

采用四氮唑盐（MTT）［6］还原法，选择人小细胞肺癌NCI－H446，非小细胞肺癌A549，食管癌Eca－109和肝癌HepG2四种肿瘤细胞模型，以吉非替尼为阳性对照，对合成的目标化合物进行体外抗肿瘤活性评价，并以人正常脐静脉内皮细胞HUVEC、肝细胞LO2、胚肺成纤维细胞MRC－5和食管上皮细胞HEEC考察化合物的体外毒性，结果如表1所示.表1中：n＝3；与吉非替尼比较，a表示P＜0.01，b表示P＜0.001.

由表1可知：TW918对NCI－H446，A549，Eca－109和HepG2四种肿瘤细胞的抑制活性均高于吉非替尼；其中，对人非小细胞肺癌A549和人肝癌HepG2细胞的抑制作用较强，表明化合物TW918可能具有潜在对肺癌、食管癌和肝癌的治疗作用.但对HUVEC，LO2，MRC－5和HEEC四种正常细胞而言，TW918和吉非替尼对它们的抑制作用明显弱于对肿瘤细胞的作用，预示TW918相对较为安全.

表1 TW918对肿瘤细胞和正常细胞的体外抗增殖活性（±s）Tab.1 Anti－proliferation activity of TW918on tumor cells and normal cells in vitro（±s）

表1 TW918对肿瘤细胞和正常细胞的体外抗增殖活性（±s）Tab.1 Anti－proliferation activity of TW918on tumor cells and normal cells in vitro（±s）

化合物 IC50／μmol·L－1 G2 HUVEC LO2 MRC－5 HEEC TW918 0.88±0.74a 0.18±0.57a 1.04±0.90b 0.39±0.28b 107±4.86b 69.1±2.91b 74.6±1.86 110±0.86 NCI－H446 A549 Eca－109 Hep b.1±3.84 102±0.16 72.5±2.73 92.1±1.66吉非替尼 6.58±1.43 3.71±0.97 10.36±1.27 5.37±0.86 83

2.3 TW918与受体激酶EGFR的分子对接验证

运用AutoDock 4.2.5软件［7］模拟底物小分子TW918与受体激酶EGFR 的分子对接，如图2所示.结果表明：TW918能以母核喹啉为头，深入占据到EGFR 的活性口袋中与ATP结合位点结合（图2），其中萘环结合激酶的疏水区域，喹啉环类似于ATP的腺苷片段，与激酶的“铰链区”结合，其最低自由结合能为－46.1kJ·mol－1，提示TW918可能具有潜在的EGFR 抑制活性.

一般认为，小分子抑制剂与靶酶结合，起主要相互作用的是抑制剂周围的氨基酸残基，而这些氨基酸残基可认为是活性残基.TW918 与EGFR 活性残基的对接作用模式，如图3 所示.由图3 可知：TW918上喹啉环与萘环间的醚键氧原子与LYS721残基上的氢发生了氢键相互作用，键长约为0.22 nm.氢键的形成有利于化合物分子更好地占据靶蛋白分子的活性口袋，提高与靶蛋白结合的紧密性.

图2 TW918与EGFR 活性位点的立体对接图Fig.2 Stereo view of TW918bound in the active site of EGFR

图3 TW918与EGFR 活性残基的对接作用模式Fig.3 Docking interaction pattern of EGFR active residues with TW918

2.4 TW918对EGFR蛋白表达的抑制作用

采用Western Blot 研 究TW918 对SMMC－7721，A549，Eca－109和SMMC－7721细胞EGFR 蛋白表达的影响，结果如图4所示.由图4可知：与阴性对照组（DMSO）相比，TW918能明显抑制四种肿瘤细胞中EGFR 蛋白的表达，且该结果呈剂量依赖性，验证了分子对接结果，表明该化合物可能通过与受体酪氨酸激酶EGFR 结合，抑制其表达，从而发挥体外抗肿瘤活性.

图4 TW918对受体激酶EGFR 蛋白表达的影响Fig.4 Effects of TW918on expression of EGFR protein

3 结论

文中合成的小分子化合物TW918是一种新的喹啉类萘甲酰胺衍生物，化合物结构经核磁共振氢谱、碳谱和高分辨质谱表征确证.MTT 结果显示：TW918对肿瘤细胞具有一定的抑制活性，但对正常细胞影响较小.分子对接结果表明：TW918能很好地深入EGFR 蛋白的活性口袋中，并与活性口袋周围的氨基酸残基形成氢键，具有潜在的EGFR 抑制活性.Western Blot实验阐明：TW918能够以剂量依赖性方式抑制EGFR 蛋白的表达，进一步验证了分子对接结果.

综上所述，TW918可能通过与受体酪氨酸激酶EGFR 结合，抑制其表达，从而发挥体外抗肿瘤活性.体外筛选和体内药效学评估是评价抗肿瘤候选药物有效性的两个重要指标.在此基础上，后续还需要通过更多的体内外实验评价TW918的抗肿瘤活性，同时深入研究其作用机理，探索是否存在除EGFR 靶点外的其他作用位点［9－10］.

［1］CHEN Xiao－guang，ZHANG Yi.Recent advance in the study of novel anti－tumor targets and drugs：Aurora kinase and Pin1［J］.Acta Pharm Sin，2009，44（3）：264－269.

［2］李娟，李延团，李晓明，等.分子靶向抗肿瘤药物研究进展［J］.生物技术通讯，2009，20（3）：411－416.

［3］WEI L，MALHOTRA S V.Recent development of cyclic amide（pyridone／lactam）moiety containing heterocycles as protein kinase inhibitors［J］.Curr Med Chem，2010，17（3）：234－253.

［4］YOSHIMURA N，KUDOH S，KIMURA T，et al.EKB－569，a new irreversible epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，with clinical activity in patients with non－small cell lung cancer with acquired resistance to gefitinib［J］.Lung Cancer，2006，51（3）：363－368.

［5］姜梦，刘丹，兰帅鹏.喹啉类蛋白酪氨酸激酶抑制剂的研究进展［J］.化学试剂，2013，35（4）：333－336.

［6］MOON D O，KIM M O，HEO M S，et al.Gefitinib induces apoptosis and decreases telomerase activity in MDA－MB－231human breast cancer cells［J］.Arch Pharm Res，2009，32（10）：1351－1360.

［7］COSCONATIL S，FORLI A，PERRYMAN A L，et al.Virtual screening with AutoDock：Theory and practice［J］.Expert Opinion on Drug Discovery，2010，5（6）：597－607.

［8］CARMI C，CAVAZZONI A，VEZZOSI S，et al.Novel irreversible epidermal growth factor receptor inhibitors by chemical modulation of the cysteine－trap portion［J］.Journal of Medicinal Chemistry，2010，53（5）：2038－2050.

［9］唐健红，曾庆友.阿魏酸异辛酯的绿色合成［J］.华侨大学学报：自然科学版，2011，32（5）：551－553.

［10］NIE Jian－yun，LIU Xin，JIN Cong－guo，et al.The effect of histone deacetylase inhibitors on cell cycle of breast cancer cell line MCF－7［J］.Clinical Medicine of China，2009，25（12）：1238－1240.