王建业，黄 钰，段进坤，朱国强

（扬州大学兽医学院 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）

鹅细小病毒鹅胚化疫苗株 SYG61v 对雏鹅毒力减弱的遗传基础分析

王建业，黄 钰，段进坤，朱国强

（扬州大学兽医学院 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）

本研究对鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）SYG61v弱毒疫苗株与5个分离于不同年代的GPV强毒株，在编码蛋白氨基酸序列及非编码调控区碱基序列进行了比对，确定了SYG61v的特征性突变位点，而5个强毒株中这些位点均高度保守。SYG61v株的VP1和Rep1蛋白，分别产生了11个和10个氨基酸位点突变。Rep1的10个突变氨基酸中，7个均处于Rep1蛋白羧基端的100个氨基酸范围内，而VP1蛋白中的10个突变氨基酸中，推测仅有1个位点处于病毒衣壳表面。在左侧末端倒置重复序列（inverted terminal repeat， ITR）与P9启动子之间非编码区，存在两段共7个碱基的连续碱基突变。SYG61v弱毒株中突变位点的确认为进一步明确他们各自在弱毒株毒力减弱中的作用奠定了基础。

疫苗株；强毒株；突变；毒力减弱；序列比对

小鹅瘟（gosling plague，GP）是由鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）所引起的雏鹅的一种急性或亚急性的败血性传染病，是当前养鹅业一种重要疫病，10日龄左右的雏鹅感染GPV后具有很高发病率和死亡率［1］。小鹅瘟的预防多采用主动免疫，当前可使用的疫苗为致弱的鹅细小病毒活疫苗，包括种鹅用的活疫苗和雏鹅用的活疫苗。种鹅开产前2周左右接种，后代雏鹅可因卵黄中母源抗体而获得被动保护。雏鹅用的活疫苗可供1日龄雏鹅使用，使雏鹅在接触野毒之前建立积极的主动免疫［2］。这两种活疫苗制剂均获得我国新兽药证书许可。

方定一等［3］1961年分离了1个GPV强毒株，命名为SYG61，在鹅胚上盲传适应后对雏鹅毒力开始减弱。供雏鹅使用的疫苗株为鹅胚上传至50代次以上的毒株，该毒株对雏鹅已完全失去致病性［4］，为区分于其亲本强毒株，将致弱的疫苗毒株命名为SYG61v。本研究对弱毒株［5］与强毒株之间在核苷酸和氨基酸水平进行了全面的比较分析，确认了在弱毒株与强毒株之间存在的特征性差异位点，这些位点在SYG61v对雏鹅的毒力减弱中不能发挥重要作用。

1 材料与方法

1.1 毒株来源 拟用于序列比对分析的毒株全基因组均已测定并公开报道。B株为匈牙利1967年分离的强毒株［6］；82-0321和06-0329为我国台湾地区的强毒分离株［7］；YZ99-6和LH株为本实验室分别于1999年和2012年分离于扬州市周边地区的强毒株［8］；SYG61v为本实验室保存的GPV鹅胚化疫苗株，已在鹅胚上传代50次以上，也是目前国内唯一批准可以在雏鹅上使用的疫苗株。所列毒株的基因组序列信息，见表1。

表1 用于序列比对的鹅细小病毒分离株遗传背景及基因组特征Table 1 GPV strains used in this study for comparison

1.2 生物软件分析 采用DNASATR 7.1软件包中的MegAlign程序对SYG61V弱毒株与其他5个GPV强毒株基因组的碱基序列以及编码蛋白的氨基酸序列进行比对。采用在线糖基化分析软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）对潜在的N-糖基化位点进行分析。

2 结果

2.1 VP1蛋白的氨基酸比对 氨基酸序列比对表明SYG61v的VP1蛋白共有11处氨基酸位点与GPV强毒株存在差异，而在这些氨基酸位点，所有强毒株均高度保守（图1）。SYG61v的突变氨基酸位点分别为N49S、Q116R、P143S、V144I、A149V、S178T、 N265T、F476L、H637Y、T672S、V718I。其中有4个氨基酸突变分布于VP1蛋白的N端独特区，2个氨基酸突变存在于VP2蛋白氨基端，在VP3蛋白中共有5处氨基酸突变。

2.2 Rep1蛋白的氨基酸比对 对Rep1蛋白的氨基酸比对分析表明SYG61v与强毒株之间共有10处氨基酸位点存在差异，而所有强毒株在这些位点均高度保守（图2）。这些突变位点是N35T、T181S、A182P、S535A、Q544E、E576D、K579E、Y592C、A602T和N609D，大多分布于Rep蛋白的羧基端，在Rep蛋白总共627个氨基酸中，近羧基端有7处突变，另外3处突变位于氨基端。

图 1 SYG61v 疫苗株和 5 个鹅细小病毒强毒株的 VP1 蛋白氨基酸序列的比对分析Fig. 1 Alignment of amino acid sequences of VP1 proteins of the vaccine strain SYG61v and five GPV virulent strains

图 2 SYG61v 疫苗株和 5 个鹅细小病毒强毒株之间Rep 蛋白氨基酸序列的比对分析Fig. 2 Alignment of amino acid sequences of Rep proteins of the vaccine strain SYG61v and five GPV virulent strains

2.3 编码蛋白糖基化位点分析 糖基化位点分析表明强毒株和疫苗株的Rep1和VP1蛋白各自拥有3个潜在的N-糖基化位点，但这些位点与强弱毒株的差异氨基酸位点均不重合。

2.4 P9启动子区的比对 P9启动子调控Rep基因的表达，P9启动子区上游紧临5ʹ端末倒置重复序列（inverted terminal repeat， ITR）。核苷酸序列比对分析表明与5个强毒株序列相比，SYG61v在P9启动子附近存在9处碱基突变，其中2个碱基突变在P9启动子（TATAA序列）下游、转录起始位点上游。最具特征的变动是在P9启动子与转录因子结合位点（ATF/CREB）之间存在两段连续的碱基突变，分别由强毒株的“GCAAT”和“CA”突变为弱毒株的“TAGGG”和“TG”（图3）。

2.5 ITR的比对分析 SYG61V弱毒株的5ʹ和3ʹ端ITR均有442个碱基组成。与B株相比，除了5ʹ端ITR在Bubble区的突出环部缺失1个碱基外，其他位置未见缺失，强毒株YZ99-6和LH在该位置也同样缺失1个碱基。SYG61v在ITR发生了多处突变，其中在发夹结构茎部存在24个碱基突变（图4），在D区存在2个碱基突变，不过这些突变均成对发生，突变后的碱基依然能够配对，D区和D '区的2个突变碱基也能够互补，因此对ITR回文结构的形成不产生影响。

3 讨论

图 3 SYG61v 弱毒株与鹅细小病毒强毒株的 P9 启动子区核苷酸序列比对分析Fig. 3 Alignment of nucleotide sequences spanning from the 5' ITR to the P9 promoter among the SYG61v and five GPV virulent strains

图 4 SYG61v 弱毒株基因组左侧末端倒置重复（inverted terminal repeat， ITR）序列（A）和右侧ITR序列（B）Fig. 4 Sequences of the left inverted terminal repeats （A） and the right inverted terminal repeats （B） of the vaccine strain SYG61v

在组成GPV衣壳的3种结构蛋白中，VP3蛋白丰度最高。依据对腺相关病毒2型（AAV-2）病毒粒子的晶体结构分析，大致有9个氨基酸结构域突出于病毒衣壳的表面，其中8个位于VP3蛋白［9-11］，这些结构域也是最可能与宿主受体相结合的区域。在SYG61v与强毒株之间存在的总共11个差异氨基酸中，仅有5个氨基酸突变存在于VP3蛋白中，这5个突变氨基酸中，仅有1个突变（F476L）可能产生于衣壳表面，其他突变位点或者不在这些区域范围内，或者毗邻这些区域，因此F476L突变位点在SYG61v弱毒株毒力减弱中的作用值得进一步深入探究。VP1蛋白氨基端独特区（VP1u）由145个氨基酸组成，该区域被证实具有磷脂酶活性，与成熟病毒粒子感染性有关［12，13］，SYG61v弱毒株在此处发生了4处突变，这些突变位点在SYG61v病毒株对雏鹅毒力减弱中的作用有待进一步分析。

Rep蛋白具有DNA结合能力，能够与ITR特定序列结合，参与病毒基因组复制进程［14，15］。Rep蛋白还能够反式作用于P40启动子，调控结构蛋白基因的转录表达［16，17］。Rep基因的羧基端分布多个重要元件，如P40启动子，mRNA剪接的donor位点和acceptor位点，ATP和NLS结合位点以及锌指结合域［11，18］。SYG61v弱毒株与其他强毒株之间相比，Rep蛋白共发生了10处氨基酸突变，其中7个处于羧基端的100个氨基酸范围内，集中于这一区域的突变位点在SYG61v对雏鹅毒力减弱中是否扮演重要角色值得进一步深入研究。

GPV拥有细小病毒科成员中最长的ITR序列［19］，SYG61v传代致弱过程中在ITR区累积了20多个碱基突变，但分析表明这些突变不影响碱基在回文区茎部的配对以及D和D区序列的配对，对基因组通过DD配对从而形成更大范围的回文并无阻碍，因此对病毒基因组复制不会产生任何影响。而在ITR下游转录因子结合位点到P9启动子之间，SYG61v存在连续的碱基突变，这些突变碱基在病毒致弱过程中生物学意义有待研究。

由于距离SYG61最初分离时间已过去50余年，加上当时科研条件制约，早期代次的强毒株已经丢失，因此简单的在SYG61V疫苗株与其亲本强毒株之间进行序列比对已经不可能。本研究选取用于比较的强毒株来自不同地区和年代，具有充分的代表性，包括了与SYG61分离年代很近的B株。通过强弱毒株间的比对，确定了在编码蛋白和调控区存在的特征性氨基酸和碱基突变，这些突变在SYG61v的致弱过程中可能发挥重要作用，累积的位点突变促使SYG61由对雏鹅致病的强毒株转变为对雏鹅失去致病性的疫苗株。但所有这些突变中，哪些氨基酸位点或碱基起关键作用尚待进一步验证，而构建GPV感染性克隆将是解决这一问题的有效手段，相关研究正在开展中。

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ANALYSIS OF THE GENETIC BASIS DETERMINING THE ATTENUATION OF A GOOSE EMBRYO-ADAPTED VACCINE STRAIN SYG61v OF GOOSE PARVOVIRUS

WANG Jian-ye， HUANG Yu， DUAN Jin-kun， ZHU Guo-qiang
（Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

s:In the present study， the amino acid sequences of the coding proteins and non-coding nucleotide sequences were compared between the attenuated vaccine strain SYG61v and five virulent strains of Goose parvovirus （GPV） with various isolation years. The typical amino acids and nucleotides alterations in SYG61v were identified， while all of these sites were conserved for five virulent strains. Eleven and ten amino acid mutations occurred in the VP1 and Rep1 protein， respectively. Within the 10 mutated amino acids for the Rep1 protein of SYG61v， seven were observed in the scope of carboxyl terminal 100 amino acids， and only one mutation site in the VP1 protein was believed to lie in the surface domain of viral capsid. In the non-coding region between the left inverted terminal repeat（ITR） and P9 promoter， two places of consecutive nucleotide mutations were found in the SYG61v. Identification of the mutations sites in the SYG61v strain could help to further explore which site alterations actually contribute the attenuation of the virulent GPV after adaptive passages in the eggs.

S852.659.2

A

1674-6422（2015）04-0019-06

2015-05-04

国家自然科学基金（31172317）；江苏高校优势学科建设工程资助项目

王建业，男，副教授，主要从事水禽病毒病研究

王建业，E-mail:wangjy@yzu.edu.cn