王海玲 万道正 张晓龙 孙肖红 梁中平 于建国 杨会敏 徐宝梁**

(1.中国检验检疫科学研究院，国家质检总局外来医学媒介生物重点实验室，北京 100121；2.凭祥出入境检验检疫局，广西凭祥 532600)

目前物种经典的分类系统是以形态特征为主要依据。形态特征是生物遗传进化过程中的间断表现形式，在很多情况下，可以作为区分物种和推断系统发育关系的依据，但是，对于有些还未达到形态改变的种，仅用形态特征来判断是不能解决问题的。对于种征而言，不同的物种会呈现类似的变异，所以一个变种可能会具有其近缘种的特征或重现祖征(Darwin, 1999)，因此，如果简单的从形态特征方面判断容易导致构建错误的系统发育关系。另一方面，形态鉴定同时容易受到个体的表型可塑性和遗传可变性的影响，从而导致不正确的鉴定结果。并且形态学鉴定受生物性别和发育阶段的限制，就会有某些生物无法被鉴定(王刚，2011)。这就不得不促使人类寻求依赖于形态学特征以外的方法进行物种分类。Hebert等(2003)对动物界，包括脊椎动物和无脊椎动物共11门13 320个物种的COⅠ基因序列比较分析，结果除腔肠动物(Cnidaria)外，98%的物种遗传距离差异在种内为0～2%，种间平均可达到11.3%，据此他提出可以用单一的小片段基因来代表物种，作为物种的条形编码，为全球生物编码。Ward等(2005)应用COⅠ基因序列进行研究，成功对澳大利亚270种海洋鱼类进行了鉴定。Ward等(2005)并对COⅠ基因序列进行分析，认为DNA条形编码不仅可以形成物种鉴定系统，还包含一定的系统发育信息，并对相关种类进行了系统发育研究。

蚊虫与人类关系密切，可传播疟疾、丝虫病、流行性乙型脑炎、登革热/登革出血热、黄热病、西尼罗热、基孔肯亚热等80多种疾病(方义亮等，2013)。简便、准确地鉴别蚊虫，是做好媒介控制的关键。本研究通过DNA条形码技术，对广西凭祥地区采集的蚊虫进行序列比对鉴定，通过序列进行种内种间遗传距离的计算和聚类分析，构建系统发育树。同时提供蚊虫条形码数据，充实COⅠ基因条形码数据库。

1 材料与方法

1.1 标本采集

所用实验样本为2013年在广西凭祥地区采集的蚊虫，形态学鉴定为：骚扰阿蚊Armigeressubalbatus，中华按蚊Anophelessinensis，三带喙库蚊Culextritaeniorhynchus，白纹伊蚊Aedesalbopictus，致倦库蚊Cx.quinquefasciatus。经现场鉴定后，对蚊虫进行分装后冷冻保存。本研究所用样本中，骚扰阿蚊4只；中华按蚊2只，三带喙库蚊5只，白纹伊蚊10只以及致倦库蚊2只。

1.2 基因组DNA提取

取出冷冻保存的蚊虫，分别进行研磨，然后用DNA提取试剂盒(TIANGEN,DP304-03)提取DNA，并保存于-20℃冰箱。

1.3 PCR反应和序列测定

COⅠ基因扩增所使用的引物参考文献合成(Folmeretal. , 1994)：P1：CO1-L(5′-G G T C A A C A A A T C A T A A A G A T A T T GG-3′)，P2：CO1-H(5′-T A A A C T T C A G G G T G A C C A A A A A A T CA-3′)。在25 μL反应体系中，加入Premix Taq(Takara)12.5 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，模板2 μL，去离子水9.5 μL。PCR反应参数为：95℃预变性1 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共35个循环；72℃延伸7 min(Cywinska, 2006)。随后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并送北京华大基因测序。

1.4 序列分析和系统树构建

用Chromos软件查看COⅠ基因序列峰图，判断峰图质量。用Clustal软件进行多重序列比对。校正后的COⅠ序列在NCBI上用BLAST程序进行同源性比对。Kimura双参数模型计算种内种间遗传距离，以邻接法(Neighbour-joining，NJ)构建系统进化树，可靠性由1 000次自展分支检验。

2 结果

2.1 蚊虫标本COⅠ基因扩增结果

使用通用引物成功扩增出23个蚊类标本的COⅠ基因片段，大小约为680 bp。电泳结果未发现非特异性杂带，通过测序，进一步验证了扩增结果。扩增结果已上传至GenBank，序列号如表1所示。

2.2 COⅠ基因的BLAST比对结果

将23个蚊虫样本COⅠ基因序列同NCBI上蚊类条形码序列进行同源性比对，结果与形态学鉴定结果一致，分别为：4只骚扰阿蚊，2只中华按蚊，5只三带喙库蚊，10只白纹伊蚊以及2只致倦库蚊。

表1 样本序列对应的GenBank序列号 拉丁名斜体Tab.1 GenBank accession numbers for nucleotide sequences

2.3 种内与种间遗传距离

用MEGA 6.0软件，基于Kimura双参数模型计算23只蚊子的种内种间遗传距离，结果见表2。

2.4 系统发育树的构建

邻接法构建的系统发育树可以反映序列之间的真实距离。本研究利用广西凭祥5种共23个COⅠ基因序列，用NJ法构建系统发育树，结果见图1。

3 讨论

对广西凭祥地区23只蚊虫样本的COⅠ基因序列在NCBI数据库进行同源性比对，结果与形态学鉴定结果一致。在应用DNA条形码技术鉴定物种时，种间遗传距离与种内遗传距离之间的分离程度十分重要，种间遗传距离和种内遗传距离没有重叠时才是有效的鉴定(Aliabadianetal., 2009)。本研究基于Kimura双参数模型计算23只蚊子COⅠ序列的种内种间遗传距离结果表明，5种蚊虫的种间差距在0.161与0.076之间，而种内遗传距离在0.022与0.003之间，种间遗传距离与种内遗传距离没有重叠，即为有效鉴定。在这5种蚊虫中，种间距离的最小值在三带喙库蚊与致倦库蚊之间，为0.076；最大值出现在中华按蚊与白纹伊蚊之间，为0.161。说明库蚊属之间差异会明显小于不同属的蚊种之间的差异。5种蚊虫的种内遗传距离在0.022与0.003之间，可以看出种间差异明显大于种内差异。这也与形态学鉴定一致，也印证了此种方法鉴定蚊虫的准确性。

表2 广西凭祥地区蚊类两两对比的中间平均遗传距离和种内遗传距离Tab.2 Average interspecies genetic distances and Average intraspecific genetic distance of mosquitoes in guangxi pingxiang

图1 NJ法构建系统发育树Fig.1 NJ tree based on analysis of COⅠ gene data

NJ法构建的系统发育树聚类分析结果表明，不同种类的蚊虫位于不同的分支，同属的蚊种分支较不同属的蚊种分支较短，种内分支则更短。每种蚊子都形成了独立的分支，这进一步证明了本次研究的有效性。

采集到的蚊虫在做成标本的情况下运输至实验室时往往会出现损坏；或者在野外采集的蚊虫放至75%酒精中带回实验室，在这种情况下单根据表型判断种类时难度比较大。若采取分子鉴定的方法，受形态完整性影响小，优势明显。

本研究以广西凭祥地区23个蚊虫个体为样本，扩增COⅠ基因序列，进行BLAST比对，计算种内及种间遗传距离，并进行序列聚类和系统发育分析，验证了基于COⅠ基因的DNA条形码技术能够简便、准确的鉴定蚊类。