全娟花 李 鹏 黄 瑞 楚佳奇**

(1. 广东医学院附属医院消化内科，广东湛江 524001；2.广东医学院附属医院干细胞研发与细胞治疗中心，广东湛江 524001)

阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis，Tv)是一种寄生于男女泌尿、生殖道的鞭毛虫，可引起滴虫性阴道炎、前列腺炎和泌尿系统炎等多种生殖系统疾病。滴虫病是常见的性传播疾病，该病呈全球性分布，人群普遍易感(Van der Pol, 2007)。滴虫的感染是引起女性宫颈癌、不孕不育以及促进人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的危险因素之一(Soper, 2004)。国外学者研究表明，阴道毛滴虫感染能诱导活性氧(ROS)介导的caspase-3依赖性中性粒细胞凋亡(Songetal., 2008)。阴道毛滴虫感染前列腺癌上皮细胞RWPE-1，可通过激活ROS，胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)和人核转录因子 (Nuclear factor kb, NF-kB)使白介素1β(IL-1β)分泌增多，进而诱发中性粒细胞和单核细胞的迁移，导致炎症反应 (Seoetal., 2014)。细胞内ROS增多还可激活蛋白激酶C并刺激细胞增殖或死亡(Schrecketal., 1991；Chenetal., 1995; Lietal., 1997;)。NAC含有硫氢基，是一种ROS清除剂(Ishikawaetal., 2008)。寄生虫在宿主体内寄生过程中，其排泄分泌物在宿主体内对免疫系统产生不良影响(Lightowlersetal., 1988)。TvESP可诱导人子宫颈癌SiHa细胞凋亡，但机制还不明确。为此，本研究利用TvESP建立SiHa细胞凋亡模型，旨在探讨：(1)NAC能否抑制TvESP引起的SiHa细胞毒性作用；(2)NAC是否通过降低胞内ROS水平来抑制TvESP诱导的SiHa细胞凋亡，明确ROS清除剂对SiHa细胞保护作用及相关机制，为进一步研制与开发治疗阴道毛滴虫的新型药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

NAC和DCFH-DA购自美国Sigma-Aldrich公司，CellTiter 96 AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒购自美国Promega公司，DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibico公司，cleaved caspase-3和PARP-1抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。人子宫颈癌SiHa细胞和阴道毛滴虫(TrichomonasvaginalisT016分离株)由韩国忠南大学感染生物学教研室提供。

1.2 阴道毛滴虫培养及Tv ESP的制备

参照Chang等(2004)的方法，将阴道毛滴虫分离株TvT016接种到螺旋口玻璃瓶内，用含10%马血清的Diamond’s trypticase yeast-extract maltose (pH=6.2)培养液于37℃、5% CO2条件下培养24 h。

参照我们前期(Quanetal., 2014)使用的方法，收集对数生长期的阴道毛滴虫，加入装有PBS的试管内, 混匀(活虫体密度为1x107/mL)，37℃培养箱培养1 h，10 000 g 离心30 min 沉淀虫体，取上清加入透析袋中，置于饱和聚蔗糖溶液中，透析后的浓缩液即为TvESP。TvESP经0.2 μm滤膜过滤，Bradford法测定蛋白浓度后置-70℃保存备用。

1.3 细胞培养

人子宫颈癌细胞SiHa在37℃、5% CO2条件下培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，2～3天换液一次，用含0.25%胰蛋白酶消化液消化后传代培养。

1.4 细胞存活率的检测

SiHa细胞接种于96孔培养板中，当细胞处于80%～90%融合状态时,根据实验需要进行不同处理：100 μg/mLTvESP处理SiHa细胞16 h(实验组)；1 mmol/L NAC预处理30 min后，再添加100 μg/mLTvESP处理SiHa细胞16 h(实验组)；1 mmol/L NAC处理SiHa细胞30 min(对照组)。每组均包括3个复孔。利用CellTiter 96 AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒检测活细胞数量。

1.5 细胞内ROS含量的检测

利用荧光探针DCFH-DA活性氧检测试剂盒检测细胞内ROS。SiHa细胞接种于24孔培养板中，当细胞处于80%～90%融合状态时,根据实验需要进行不同处理,16 h后用HBSS漂洗盖玻片两次, 加入10 μmol/L DCFH-DA染液于37℃孵育15 min。再用HBSS漂洗盖玻片两次，DAPI荧光封片剂封片，20 min后在荧光显微镜下摄片。

1.6 免疫印记法检测cleaved caspase-3和PARP-1蛋白表达

按1.4中描述的方法将实验分组处理完成后收集各组细胞，用细胞裂解液处理细胞后提取细胞总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，每组取40 μg总蛋白进行SDS-PAGE分离，将凝胶上蛋白转印至PVDF膜上，分别用抗Cleaved caspase-3、PARP-1和α-Tubulin抗体于4℃孵育过夜，再用过氧化物酶标记二抗孵育，最后通过强化学发光可视剂曝光。

1.7 统计学处理

实验数据用SPSS13.0软件进行统计分析，所有结果以均数±标准差表示，组间比较采用One-way ANOVA及LSD-t检验，P

2 结果

2.1 体外成功培养阴道毛滴虫T016分离株

将阴道毛滴虫T016分离株进行常规培养，通过计数了解生长情况并观察阴道毛滴虫的形态。图 1结果显示，培养24 h后，阴道毛滴虫达到生长高峰，虫体呈现多分裂相、虫体变大、呈圆形、内含多个胞核、胞膜外缘可见数丛鞭毛。

图1 阴道毛滴虫T016分离株形态Fig.1 Morphology of Trichomonas vaginalis T016

2.2 NAC抑制Tv ESP引起的SiHa细胞毒性

如图2所示，100 μg/mLTvESP处理SiHa细胞16 h后，细胞存活率明显降低。1 mmol/L NAC预处理30 min，再用TvESP处理，可观察到TvESP的细胞毒性作用减弱，提示ROS清除剂NAC能降低TvESP对SiHa细胞的毒性作用。1 mmol/L NAC本身不影响SiHa细胞存活率。

图2 N-乙酰-L-半胱氨酸保护滴虫排泄分泌物对SiHa细胞引起的细胞毒性Fig.2 N-acetylcysteine(NAC) inhibits SiHa cell cytotoxicity induced by Trichomonas vaginalis excretory-secretory products (Tv ESP)

利用CellTiter 96 AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒检测SiHa对照组(SiHa Control)、滴虫排泄分泌物组(TvESP)、N-乙酰-L-半胱氨酸+滴虫排泄分泌物组(NAC+TvESP)和N-乙酰-L-半胱氨酸组(NAC)细胞存活率。“*”表示与SiHa正常对照组比较有显著性差异(P<0.05)；“#”表示与滴虫排泄分泌物组比较有显著性差异(P<0.05)。

Cell viability of SiHa Control、TvESP、NAC+TvESP and NAC group were analyzed by CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay System. * indicates the significant difference(P<0.05)as compared with SiHa control group; # indicates the significant difference(P<0.05)as compared withTvESP group(P<0.05).

图3 N-乙酰-L-半胱氨酸抑制滴虫排泄分泌产物生成的活性氧Fig.3 N-acetylcysteine(NAC) inhibits the production of reactive oxygen species(ROS)induced by Trichomonas vaginalis excretory-secretory products (ESP)

2.3 NAC抑制Tv ESP对ROS生成的作用

DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜。进入细胞后，可被细胞内的酯酶水解成DCFH，因DCFH不能自由透过细胞膜，易被装载到细胞内。胞内ROS可将无荧光的DCFH氧化成发绿色荧光的DCF。绿色荧光的强弱可以间接反映细胞内ROS水平。图3结果显示，TvESP作用人子宫颈癌SiHa细胞16 h，可使胞内ROS生成增多。而应用ROS清除剂NAC(1 mmol/L)预处理30 min后再用TvESP作用SiHa细胞16 h，能显著减少TvESP诱导的胞内ROS生成。

2.4 NAC抑制Tv ESP诱导的cleaved caspase-3和cleaved PARP-1表达

为了解TvESP诱发SiHa细胞凋亡的分子机制，采用免疫印记法检测SiHa细胞cleaved caspase-3和PARP-1的表达水平。结果显示，与对照组比较，TvESP组SiHa细胞中procaspase-3被激活后产生的17、19 kDa的cleaved caspase-3显著高于对照组，活化的cleaved caspase-3切割PARP-1产生的片段(cleaved PARP-1，89 kDa)也显著高于对照组。而用NAC预处理后cleaved caspase-3和cleaved PARP-1表达显著降低(图4)。以上结果表明，TvESP诱导细胞产生的ROS可激活caspase-3并启动对其底物PARP-1的切割，而NAC可抑制此反应。

图4 免疫印记法检测激活型半胱天冬酶-3和腺苷二磷酸核糖聚合酶-1的表达Fig.4 Detection of cleaved caspase-3 and(poly(ADP-ribose)polymerase-1)(PARP-1)by Western blot收集SiHa对照组(SiHa Control)、滴虫排泄分泌物组(Tv ESP)、N-乙酰-L-半胱氨酸+滴虫排泄分泌物组(NAC+ Tv ESP)和N-乙酰-L-半胱氨酸组(NAC)细胞并利用免疫印记法检测激活型半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)蛋白表达。α微管蛋白(α-tubulin)作为内参。SiHa Control, Tv ESP, NAC+ Tv ESP and NAC group cells were collected. Cleaved caspase 3 and PARP-1 protein levels were analyzed by Western blot. α-tubulin was used as loading control.

3 讨论

本研究证实，TvESP对SiHa细胞具有明显的细胞毒性作用，使细胞存活率显著降低。TvESP对SiHa细胞的毒性作用可能与其诱导的氧化应激反应有关，主要表现在能使SiHa细胞内的ROS生成增多。本文观察到ROS清除剂NAC预处理能明显降低TvESP对SiHa细胞毒性作用，使细胞存活率升高，进一步证实了上述推论。据报道，紫花牡荆素可诱导ROS产生并通过激活线粒体凋亡途径诱发宫颈癌SiHa细胞凋亡(Chenetal., 2011)。本研究结果表明，TvESP可使细胞ROS水平升高并具有细胞毒性作用，而NAC在抑制TvESP引起细胞毒性作用的同时，能显著减少ROS生成，提示NAC抑制TvESP的细胞毒性作用可能与胞内ROS的产生减少有关。

Caspase-3是细胞凋亡的关键效应分子，通常以无活性的procaspase-3存在,当细胞受到凋亡信号激活或各种外界有害物质刺激时，procaspase-3被剪切激活后就转变为有活性的cleaved caspase-3,诱发细胞凋亡(Nicholsonetal., 1995)。PARP-1是一种存在于真核细胞中的蛋白质翻译后修饰酶，催化聚ADP核糖化的细胞核酶，其主要作用是参与DNA的损伤修复(Satohetal., 1992)。PARP-1为caspase-3的底物，大小为116 kDa，在有些细胞凋亡过程中被裂解成89 kDa和24 kDa两个片段，因此cleaved PARP-1裂解片段(89 kDa)经常被作为细胞早期凋亡的证据(Kohetal., 2005)。本研究用TvESP处理SiHa细胞16 h后，cleaved caspase-3和cleaved PARP-1表达明显升高。NAC预处理后可显著下调cleaved caspase-3和cleaved PARP-1表达，提示NAC能显著降低TvESP诱导的胞内ROS水平，抑制SiHa细胞凋亡。本研究结果进一步阐明了TvESP诱导产生细胞毒性的作用机制，为治疗阴道毛滴虫的新型药物的研制与开发提供理论依据。