杨珮珮 彭晶 于作忠 施歌 黎兆军 张国学 樊翌明

对称性肢端角化病皮损中脂肪酸结合蛋白5及二氢硫辛酰胺脱氢酶表达

杨珮珮 彭晶 于作忠 施歌 黎兆军 张国学 樊翌明

目的探讨脂肪酸结合蛋白5（FABP5）及二氢硫辛酰胺脱氢酶（DLD）在对称性肢端角化病中的表达和意义。方法收集9例对称性肢端角化病患者腕部皮损及其周围皮肤活检标本，9例健康人腕部皮肤为对照，用逆转录PCR（RT-PCR）及免疫组化法检测FABP5及DLD表达水平。结果RT-PCR显示，FABP5 mRNA及DLD mRNA表达在对称性肢端角化病患者腕部皮损、皮损周围皮肤、健康人腕部皮肤3组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。免疫组化显示，对称性肢端角化病皮损中FABP5阳性染色范围和强度增加，角质层、颗粒层、棘层均有强染色；而皮损周围皮肤中角质层、颗粒层及棘层弱阳性染色，健康对照皮肤中仅有棘层和基底层弱阳性染色。对称性肢端角化病皮损中DLD表达减少，仅在角质层和少数病例棘层表达；皮损周围及健康人皮肤表皮全层均有DLD阳性染色，胞核、胞质均呈深棕色。结论对称性肢端角化病皮损中FABP5高表达可能参与角质形成细胞异常分化过程，而DLD表达下调提示存在能量代谢失衡。

角化病；脂肪酸结合蛋白质类；二氢硫辛酰胺脱氢酶；对称性肢端角化病

对称性肢端角化病（symmetrical acrokeratoderma，SAK）是我国学者姜袆群等［1］、朱晓浚等［2］于2008年首次报道并命名的一种皮肤病。樊翌明等［3］于2010年首次在国际上以“获得性SAK”为名报道了2例，并对国内报道的27例进行了总结。目前国际皮肤科学界已认可SAK是一种新的皮肤病［4］。迄今国内共报道了212例SAK，国外未见报道［5-8］。SAK病因与发病机制不明。我们发现SAK皮损中炎症细胞明显增多［5］，而李常兴等［6］的研究显示，SAK 皮损中存在屏障功能受损。在前期的蛋白组学研究中，我们发现SAK皮损中脂肪酸结合蛋白5（fatty acid binding protein 5，FABP5）表达明显高于正常皮肤，而二氢硫辛酰胺脱氢酶（dihydrolipoamide dehydrogenase，DLD）表达明显降低。FABP5是一个脂质载体，能结合转运脂肪酸，参与多种生物过程［9］，在正常皮肤中表达较低［9-10］，在银屑病皮损中过度表达［11］。DLD是线粒体多酶复合物的共同黄素蛋白组分，参与氧化还原反应，维持能量代谢平衡［12］。DLD缺乏或基因突变多引起代谢性疾病［13］，在正常皮肤中表达迄今未见报道。我们拟用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫组化技术，进一步验证SAK皮损、皮损周围皮肤和健康人皮肤中FABP5 mRNA和DLD mRNA及蛋白表达差异，为今后进行基因功能研究奠定基础。

作者单位：524001湛江，广东医学院附属医院皮肤科［杨珮珮（现在湖北省荆门市第二人民医院皮肤科，448000）、彭晶、于作忠、施歌、黎兆军、张国学、樊翌明］

对象和方法

一、对象

2009年9月至2014年11月，对9例SAK患者腕部皮损进行活检，其中男8例，女1例，年龄20～37（25.67±5.94）岁，发病年龄 13～24（18.89±3.26）岁。SAK诊断根据临床特征和病理检查［1-3］，9例均在肢端部位发生对称性褐色角化性斑片，特别是手背、腕、踝部，掌跖不受累。皮损在浸水或出汗几分钟后变白，干燥后恢复原状。皮损夏季出现，冬季减轻或消退。皮损组织病理检查显示，表皮角化过度，棘层增厚，轻度乳头瘤样增生，真皮浅层血管周围稀疏淋巴样细胞浸润。9例腕部正常皮肤取自本机构学生及医生志愿者，男6例，女3例，年龄15～53（27.33±10.59）岁。两组年龄差异无统计学意义（t=0.412，P=0.686）。活检标本分别用液氮冷冻及4%甲醛固定。本研究经广东医学院附属医院伦理委员会审查批准，所有受检者均签署了知情同意书。

二、方法

1.RT-PCR：人FABP5、DLD和GAPDH引物序列采用Primer 3软件设计，由生工生物工程（上海）有限公司合成：FABP5：上游引物5′-TCAGCAGCTG GAAGGAAGAT-3′和下游引物 5′-CTTTCCTTCCCA TCCCACTC-3′；DLD：上游引物 5′-GCTCTTCTGGTG GTAAAGC-3′和下游引物 5′-GGATCTTCACCATGC CATCT-3′；GAPDH：上游引物 5′-CGAGATCCCTCC AAAATCAA-3′和下游引物 5′-GTCTTCTGGGTGGC AGTGAT-3′。液氮保存皮肤标本加入Trizol试剂（美国Invitrogen公司）提取总RNA，再用逆转录酶M-MLV试剂盒［宝生物工程（大连）有限公司］合成cDNA及S1000TMThermal Cycler PCR仪（美国Bio-Rad公司）进行PCR扩增。PCR反应体积为20 μl，反应体系为Premix Ex TaqTMⅡ（2×）［宝生物工程（大连）有限公司］10.0 μl，PCR 混合引物（10 μmol/L）1 μl，cDNA 模板 1 μl，加灭菌蒸馏水至 20 μl。扩增条件为：98℃预变性 5 min，98℃变性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30～40个循环，72℃延伸5 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统（美国UVP公司）观察、拍照，再用Image J系统检测灰度值，计算FABP5、DLD mRNA灰度值与GAPDH mRNA灰度值之比。

2.免疫组化检测：兔抗人 FABP5（sc-50379）及DLD（sc-135027）多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），即用型免疫组化EliVisionTMplus试剂盒（KIT-9902）、加强型 DAB 显色试剂盒（DAB-2031）（福州迈新生物技术公司）。石蜡切片（厚度3 μm）脱蜡、水化，采用柠檬酸盐高温高压法修复抗原，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶；滴加一抗（工作浓度1∶200），4℃孵育过夜后室温孵育2 h；EliVisionTMplus试剂盒处理后DAB显色。以PBS替代一抗作为阴性对照，每张切片随机选择10个不同视野（×400），观察染色范围及染色强度。染色范围指阳性染色细胞占各层细胞比例：0（-），1% ～ 25%（+），26% ～ 50%（++），51% ～ 75%（+++），76% ～ 100%（++++）。染色强度指阳性染色颗粒颜色：阴性（-），淡黄色（+），棕黄色（++），深棕色（+++），棕黑色（++++）。

3.统计学方法：采用方差分析及LSD检验（方差齐）或Dunnett T3检验（方差不齐）。

结 果

一、RT-PCR检测FABP5和DLD mRNA表达

RT-PCR结果显示，FABP5和DLD mRNA在SAK皮损、皮损周围皮肤和健康对照皮肤中的表达差异无统计学意义（图1、表1）。

二、免疫组化染色

图1 对称性肢端角化病（SAK）皮损中脂肪酸结合蛋白5（FABP5）及二氢硫辛酰胺脱氢酶（DLD）mRNA RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳 3组皮肤中FABP5、DLD mRNA表达无明显差异

表1 各组皮肤中脂肪酸结合蛋白5（FABP5）及二氢硫辛酰胺脱氢酶（DLD）mRNA表达水平（±s）

表1 各组皮肤中脂肪酸结合蛋白5（FABP5）及二氢硫辛酰胺脱氢酶（DLD）mRNA表达水平（±s）

注：表达水平为FABP5、DLD mRNA灰度值与GAPDH mRNA灰度值之比

组别 例数 FABP5 DLD对称性肢端角化病皮损 9 0.651±0.625 0.499±0.572皮损周围皮肤 9 0.321±0.353 0.677±0.799健康对照皮肤 9 0.358±0.359 0.642±0.615 F值 1.375 0.179 P值 ＞0.05 ＞0.05

1.FABP5：FABP5阳性染色主要为胞质着色，少数可见胞核染色。SAK皮损中FABP5染色均为强阳性（图2A），着色主要见于角质层、颗粒层及棘层，基底层仅1例阳性染色，阳性细胞数约占棘层75%～100%。皮损周围染色为弱阳性或阴性（图2B），阳性着色见于角质层、颗粒层及棘层，阳性细胞数约占各层25%～50%。健康对照皮肤染色为弱阳性或阴性（图2C），阳性着色主要见于棘层与基底层，阳性细胞数约占各层25%～50%，少数完全为阴性。所有标本可见小汗腺导管内层胞质着色，部分标本可见毛囊皮脂腺染色。SAK皮损、皮损周围及健康对照皮肤中真皮浅层均有少量浸润细胞表达FABP5。见表2。

2.DLD免疫组化染色结果：SAK皮损（图3A）、皮损周围（图3B）及健康对照皮肤（图3C）中DLD染色均为阳性，但皮损中染色较弱（表3）。皮损中阳性着色主要见角质层，部分病例在棘层可见胞核、胞质均着色，基底层偶见阳性。皮损周围及健康对照皮肤中阳性着色见于表皮全层，胞核、胞质均呈深棕色。所有标本可见小汗腺导管细胞部分胞核着色，部分标本可见毛囊内根鞘细胞核及皮脂腺腺泡细胞胞质阳性染色。

讨 论

图2 脂肪酸结合蛋白5免疫组化染色（×200） 2A：对称性肢端角化病皮损中角质层、颗粒层及棘层均有强阳性表达；2B：皮损周围皮肤中颗粒层及棘层弱阳性染色；2C：健康对照皮肤仅棘层下部弱阳性染色

表2 脂肪酸结合蛋白5在对称性肢端角化病（SAK）皮损及皮损周围皮肤和健康对照皮肤表皮各层染色情况

图3 二氢硫辛酰胺脱氢酶（DLD）免疫组化染色（×200） 3A：对称性肢端角化病皮损中角质层及部分棘层细胞阳性表达；3B：皮损周围皮肤中表皮全层均有阳性染色；3C：健康对照皮肤表皮全层均有阳性染色

表3 二氢硫辛酰胺脱氢酶在对称性肢端角化病（SAK）皮损及皮损周围皮肤和健康对照皮肤表皮各层染色情况

本文结果显示，SAK皮损、皮损周围皮肤及健康对照皮肤中FABP5 mRNA表达差异无统计学意义，但免疫组化显示，皮损中FABP5蛋白表达明显上调。FABP5在正常皮肤中表达较低，只表达在分裂后角质形成细胞（KC），而基底细胞和暂时扩增细胞几乎不表达。有研究显示，银屑病皮损中FABP5表达增多，主要位于棘层［9-10］。重组FABP5转染健康人KC诱导角蛋白K10和外皮蛋白高表达，而RNA干扰抑制FABP5的NF-κB和JNK信号通路，下调K10和外皮蛋白表达［9］。在银屑病皮损KC培养过程中，抑制FABP5使细胞分化明显减少；在高钙（1.8 mmol/L氯化钙）条件下，FABP5沉默下调K10和外皮蛋白表达，而生存素和K16表达几乎完全消失［9］。这些结果表明，FABP5在KC分化中有重要作用，可能是导致银屑病皮损中KC异常分化的原因之一［9］。我们前期的免疫组化研究发现，SAK皮损中K16、外皮蛋白表达明显上调，而K10表达与正常皮肤相似。SAK皮损中FABP5、K16、外皮蛋白表达模式类似于银屑病，提示FABP5可能通过调节K16、外皮蛋白表达参与KC异常分化过程。此外，FABP5参与辅助T细胞、神经细胞等多种细胞的分化过程，在一些免疫相关细胞（如肺泡内巨噬细胞、胸腺皮质细胞、脾树突细胞、肥大细胞）中也有表达［9，14］。本研究发现，SAK 皮损、皮损周围皮肤及健康对照皮肤中真皮浅层均有少量浸润细胞表达FABP5，提示免疫细胞中FABP5表达可能在本病发生中无明显作用。

DLD是线粒体多酶复合物的共同黄素蛋白组分，参与体内多种代谢途径，维持能量代谢平衡［12］。在生理条件下，DLD的主要功能是维持能量代谢平衡；在病理条件下，如不稳定二聚体突变或者酸性线粒体基质环境下，DLD的兼职硫辛酰胺脱氢酶活性增加，导致能量代谢减少，氧化性损害增加［12］。体内氧自由基增多引起线粒体DNA突变、呼吸链损伤、线粒体膜损伤、线粒体钙稳态破坏，促进细胞凋亡及机体老化［14］。皮肤中DLD表达及其生物学作用迄今未见报道，本研究检测了SAK皮损及健康人皮肤中DLD表达情况。RT-PCR发现DLD mRNA在SAK皮损、皮损周围皮肤及健康对照皮肤中表达差异无显著性；免疫组化显示，健康表皮全层均有DLD阳性染色，而SAK皮损中DLD表达减少，仅在角质层和少数病例棘层表达。鉴于DLD的主要作用是维持能量代谢平衡，DLD表达下调提示SAK皮损中存在能量代谢失衡。

由于在基因转录和翻译过程中存在RNA降解和修饰、转录及翻译后调节，故mRNA与蛋白质表达结果可能不一致［15］。本文的免疫组化染色支持前期的蛋白组学结果，但SAK皮损中FABP5和DLD mRNA表达未见明显变化。SAK皮损中FABP5高表达可能参与KC异常分化过程，其具体通路有待继续研究；SAK皮损中DLD表达下调，提示存在能量代谢失衡，角质形成细胞中线粒体基质环境、能量代谢及硫辛酰胺脱氢酶活性变化及其在本病发生中的作用有待进一步研究。

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Expressions of fatty acid binding-protein 5 and dihydrolipoamide dehydrogenase in skin lesions of symmetrical acrokeratoderma

Yang Peipei,Peng Jing,Yu Zuozhong,Shi Ge,Li Zhaojun,Zhang Guoxue,Fan Yiming*.*Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001,Guangdong,China

ObjectiveTo investigate the expressions of fatty acid-binding protein 5 （FABP5）and dihydrolipoamide dehydrogenase（DLD）in skin lesions of symmetrical acrokeratoderma（SAK）,and to explore their significance.MethodsBiopsy specimens were obtained from skin lesions on the wrists and perilesional skin of 9 patients with SAK,and from normal skin in the wrists of 9 healthy volunteers（control group）.Reverse transcription PCR （RT-PCR）and immunohistochemical staining were performed to measure the expressions of FABP5 and DLD in these specimens.ResultsRT-PCR showed no significant differences in the mRNA expressions of FABP5 or DLD between lesional,perilesional and normal control skin specimens（bothP＞ 0.05）.Immunohistochemically,there was a significant increase in the extent and intensity of staining for FABP5 in SAK lesions.Concretely speaking,FABP5 was strongly expressed in the stratum corneum,granular and spinous layers in SAK lesions,but weakly expressed in the stratum corneum,granular and spinous layers in perilesional skin,and only in spinous and basal layers in normal control skin.The expression of DLD decreased in SAK lesions,and was observed only in the stratum corneum and spinous layer in a few cases of SAK.However,the full-thickness epidermis stained positive for DLD in perilesional skin,with the nuclei and cytoplasm both stained deep brown.ConclusionThe overexpression of FABP5 in SAK lesions may participate in dysdifferentiation of keratinocytes,while the down-regulation of DLD expression suggests an imbalance in energy metabolism.

Keratosis;Fatty acid-binding proteins;Dihydrolipoamide dehydrogenase;Symmetrical acrokeratoderma

Fan Yiming,Email:ymfan1963@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.12.004

广东医学院科技创新基金（STIF201103）

樊翌明，Email：ymfan1963@163.com

2015-05-27）

（本文编辑：颜艳）