樊卫飞 王峻 王琳 孟丽娟 蒲骁麟 杨民 许菊青

恶性胸腹腔积液中肿瘤细胞的TSmRNA表达水平与培美曲塞药物敏感性关系

樊卫飞 王峻 王琳 孟丽娟 蒲骁麟 杨民 许菊青

目的 分析恶性胸腹腔积液中原代肿瘤细胞胸苷酸合成酶（TS）基因的mRNA表达水平，探讨TS基因在恶性胸腹腔积液患者中对培美曲塞药物化疗疗效的预测作用。 方法 收集39例经病理确诊的Ⅳ期恶性肿瘤患者的恶性胸腹腔积液，分离原代肿瘤细胞，采用ATP-TCA法体外药物敏感试验检测化疗药物对原代肿瘤细胞的抗肿瘤作用；提取原代肿瘤细胞的总RNA，采用实时荧光定量PCR方法检测原代肿瘤细胞中培美曲塞药物疗效相关基因TS的相对表达水平。 结果 在恶性胸腹腔积液中，原代肿瘤细胞中TSmRNA的相对表达水平与恶性肿瘤患者的临床特征无明显相关性（P＞0.05）；TSmRNA表达水平与培美曲塞药敏结果呈负相关，TS低表达，培美曲塞更敏感（P＜0.05）。 结论 恶性胸腹腔积液中原代肿瘤细胞TSmRNA的表达水平与培美曲塞体外药物敏感性相关。对于有恶性胸腹腔积液患者，可通过简单的胸腹腔穿刺获得与化疗药物疗效相关的基因信息，从而为恶性胸腹腔积液患者实施个体化治疗提供理论基础。

胸苷酸合成酶；恶性胸腹腔积液；培美曲塞

恶性肿瘤的治疗问题是当今医学领域广泛关注的研究方向。由于肿瘤本身和不同病人之间肿瘤异质性的存在，使得目前应用的抗肿瘤药物对≥70%的患者疗效有限。检测肿瘤的药物敏感性基因，参考检测结果选择敏感的药物进行个体化治疗，已经成为当前提高疗效、减少无效治疗的有效措施［1-2］。绝大多数晚期恶性肿瘤患者在疾病进展过程中均会发生转移，与原发灶相比，转移灶具有不同的生物学行为。培美曲塞是新一代多靶点叶酸拮抗剂，在非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗中取得了较好的疗效［3］，同时在胃肠消化道肿瘤治疗中作为二线化疗药物的地位逐渐提高。胸苷酸合成酶（TS）是DNA合成的关键酶，其表达水平可能与培美曲塞的疗效相关［4-5］。

临床上，恶性胸腹腔积液是一种易于获取的标本，相对于病情较晚无手术适应证患者或者体力状况较差、年龄较高无法耐受胃肠镜、支气管镜、穿刺活检等操作的患者显得尤为重要。且对患者创伤较少，可重复操作，因此恶性胸腹腔积液在个体化疗领域具有独特的意义［6-8］。

本研究旨在探索：（1）肿瘤特殊转移灶即恶性胸腹腔积液中肿瘤细胞的TSmRNA表达水平与培美曲塞药物敏感性的关系；（2）恶性胸腹腔积液是否可以作为一种合适的标本，以获得药物敏感性预测分子方面的信息，从而为实施个体化治疗提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 对象

1.1.1 药品与试剂：TRIzol试剂盒为GIBCO公司产品；实时荧光定量 PCR试剂盒 ExTaq R-PCR为TaKaRa产品；培美曲塞由江苏豪森医药股份公司提供（国药准字 H20051288）；细胞活性萤光检测试剂CellTiter-GIo Luminescent Cel Viability Assay为美国Promega公司产品；Taqman探针及引物为美国ABI公司产品；其余试剂为国产分析纯。

1.1.2 研究对象：收集2010年3月至2014年8月在我院经病理确诊的转移性恶性胸腹腔积液患者共39例，男20例，女19例，年龄34～81岁，平均（61.0± 5.2）岁，其中包含NSCLC组17例，胃肠癌组22例，其中胃癌10例，肠癌12例。经细胞涂片病理学检查证实，恶性胸腹腔积液中肿瘤细胞含量≥50%；患者标本收集前1月未接受过全身抗肿瘤治疗或胸腹腔局部治疗；需要记录的基本项目（包括患者的病理资料，在病程中先后使用的化疗药物，以及使用疗效，生存期）在病历中完整记载。

1.2 方法

1.2.1 分离肿瘤细胞：将收集的恶性胸腔或腹腔积液离心；小心吸取中间白膜层至新管中加入红细胞裂解液20 ml，用含抗生素的RPMI 1640洗涤细胞。

1.2.2 ATP-TCA法药物敏感性测定：调整细胞浓度，接种于96孔板，同时加入不同浓度的化疗药物，同时设立无药对照组（MO）和ATP最大抑制对照组（MI），每组设12个平行孔。将培养板于37℃、5%二氧化碳饱和湿度的培养箱孵育6 d后取出；加入CellTiter-GIo试剂，应用Berthold Detection Systems微孔板光度计检测荧光值，并计算各药物浓度下肿瘤细胞的生长抑制率；抑制率（inhibition rate，IR）=［1-（实验组荧光值-MI荧光值）/（MO荧光值-MI荧光值）］×100%。药物敏感指数为600表示最大范围的细胞存活，即最小程度的药物敏感；药物敏感指数为0表示细胞完全死亡，即最大程度的药物敏感。药物敏感指数越小，说明细胞对该药越敏感。

1.2.3 RNA提取及cDNA的合成：分离后的胸腹腔积液肿瘤细胞，参照Trizol的说明书提取细胞总RNA。配制逆转录反应体系，逆转录完成后，将cDNA置于-20℃保存。

1.2.4 实时荧光定量PCR：将各组cDNA溶液分别与SYBRpPCR混合物、上下游引物、灭菌蒸馏水一起加样。实时荧光定量 PCR循环参数为：95℃预变性10 s，95℃变性5 s，60℃退火，延伸30 s，45个循环。TS引 物 序 列：5′-TCAGCGAGAACCCAGACC-3′。5′-CCAGTGGCAACATCCTTAA-3′；β-actin引物序列：5′-TATGACTTAGTTGCGTTACACC-3′。5′-CCTTCACCGTTCCAGTTT-3′，琼脂糖凝胶电泳30 min。凝胶图像分析仪分析结果。

1.3 统计学分析 组间定量资料比较分析采用t检验，在分析相关基因表达水平与药物敏感性的关系时，如果数据符合正态分布或经对数转换后符合正态分布则采用Pearson's相关分析，反之则采用Spearman相关性分析。统计软件为SPSS 18.0。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 恶性胸腹腔积液中培美曲塞药物敏感指数与肿瘤细胞TSmRNA表达的相对定量 本研究中标本收集、处理过程中严格无菌操作，ATP-TCA检测得以在全部标本中完成。TSmRNA在原代肿瘤细胞中的表达以及培美曲塞在不同组别的药物敏感指数见表1。原代肿瘤细胞对培美曲塞的敏感性与患者临床病理特征：TSmRNA在NSCLC细胞中的表达水平低于在胃肠癌细胞中的表达水平。TSmRNA的表达与患者的年龄、性别、原发肿瘤类型均无关。

表1 2组胸腹腔积液中培美曲塞药物敏感指数与肿瘤细胞TSmRNA表达的相对定量

2.2 TSmRNA的表达和肿瘤对培美曲塞的敏感指数的相关性 TSmRNA的表达和肿瘤对培美曲塞的敏感指数呈显著正相关（NSCLC组r=0.672，P=0.03；胃肠癌组r=0.506，P=0.048），即恶性胸腹腔积液中低表达TSmRNA者体外对于培美曲塞敏感性高。见图1及图2。

3 讨论

图1 NSCLC组TSmRNA表达及对培美曲塞敏感性的关系

图2 胃肠癌组TSmRNA表达及对培美曲塞敏感性的关系

现有的多项体外实验表明，肺癌细胞中TS高表达将降低其对培美曲塞的敏感性［9］。有研究发现采用培美曲塞为基础的方案治疗NSCLC，TS低表达患者的无疾病进展期（PFS）明显高于高表达者；同时还发现低表达患者的总生存期（OS）也明显高于高表达患者［10］。在本项研究中，我们首次试图探索在特殊的肿瘤转移灶即恶性胸腹水中肿瘤细胞TSmRNA表达水平与培美曲塞药物敏感性的关系。既往研究多关注原发肿瘤，且检测标本大多数采集于化疗前，而病人经多周期化疗后可产生一定程度耐药性，而恶性胸腹腔积液在采集后立即行分子生物学检测，具有实时性，可为实时个体化治疗提供理论依据。

本试验结果表明，不论在肺癌组还是在胃肠癌组，恶性胸腹腔积液中肿瘤细胞TSmRNA表达水平均与培美曲塞药物敏感性呈负相关；即TSmRNA低表达者体外培美曲塞敏感性高。

总而言之，对于伴有恶性胸腹腔积液的进展期NSCLC以及胃肠癌患者，有可能通过相对简单、无创的胸腹腔穿刺获得合适的标本进行相关基因表达的分析，从而实现对化疗药物敏感性的预测，为实施肿瘤的个体化治疗带来希望。当然，由于体外药物敏感试验的结果不能完全等同于体内病人对该种药物的反应性，临床前试验的结果仍然有待于在进一步大样本临床试验中得到证实。但由于本研究的样本量较少，其价值和可靠性尚需要更多研究结果的支持。

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Relationship between mRNA expression of thym idylate synthase（TS）in malignant p leural and peritoneal effusions and chemosensitivity to pemetrexed

FAN Wei-fei，WANG Jun，WANG Lin，MENG Li-juan，PU Xiao-lin，YANGMin，XU Ju-qing. Department ofOncology，Jiangsu Provincial Geriatric Hospital，Nanjing 210024，China

Objective To explore themRNA expression of thymidylate synthase（TS）in tumor cells isolated from malignant pleural and peritoneal effusions，and to investigate the predictive role of TS to the efficacy of pemetrexed-based chemotherapy. M ethods Tumor cells were isolated from malignant pleural and peritoneal effusions of 39 patients with malignant tumor.Viable tumor cells were tested for sensitivity to pemetrexed using ATP-TCA assay.RT-PCR was used to examine the TS mRNA level in the primary cultured cancer cells. Results The expression level of TS mRNA in malignant effusions was negatively correlated with pemetrexed sensitivity.The expression of TSmRNA was not related to age，gender or tumor type. Conclusions The results indicate that the expression level of TS mRNA in malignant effusions is negatively correlated with sensitivity to pemetrexed.Chest or abdominal puncturemay play an important role for “real-time”individualized chemotherapy while tumor progression.

thymidylate synthase；malignant pleural and peritoneal effusions；pemetrexed

R 734

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.09.011

江苏省卫生厅医学科研面上项目（H201329）；江苏省六大高峰项目（2013-WSN-057）

210024江苏省南京市，江苏省老年医院肿瘤科

2015-03-10）