周亭芳，李高峰，李 朵，崔迎红，杨小红，曹建国，罗 琼

（1.株洲市中心医院肿瘤科，株洲 412001；2.湖南师范大学医学院药学系，长沙 410013）

白杨素增强辐射诱导宫颈癌HeLa细胞系球形成细胞凋亡

周亭芳1，李高峰1，李 朵2，崔迎红2，杨小红2，曹建国2，罗 琼2

（1.株洲市中心医院肿瘤科，株洲 412001；2.湖南师范大学医学院药学系，长沙 410013）

目的：研究白杨素对宫颈癌HeLa细胞系球形成细胞（SFCs）放疗增敏作用。方法：干细胞条件培养基悬浮培养得到人宫颈癌HeLa细胞系SFCs。DNA/组蛋白酶联免疫吸附试验（ELISA）检测辐射诱导SFCs和亲本细胞凋亡作用。Western blot分析SFCs和亲本细胞p-STAT3蛋白表达。结果：与亲本细胞相比，HeLa细胞系SFCs耐受细胞凋亡。20.0μmol/L 白杨素增强辐射诱导SFCs凋亡作用。20.0μmol/L 白杨素降低SFCs STAT3磷酸化水平。结论：白杨素增强辐射诱导人宫颈癌HeLa细胞系SFCs凋亡作用与其抑制STAT3活性相关。

宫颈癌；放射治疗；肿瘤干细胞；细胞凋亡；STAT3

放疗是宫颈癌的重要治疗手段之一，约70%的患者需要接受放射性治疗，然而，约1/3的患者在治疗后复发［1］。新近研究表明，宫颈癌球形成细胞（sphere forming cells，SFCs）即宫颈癌干细胞样细胞是导致放疗抵抗和复发的主要原因［2］。Chen等研究证实STAT3抑制剂葫芦素Ⅰ（JSI-124）增强辐射诱导人头颈部鳞状上皮细胞癌CD44+ALDH1+干细胞样细胞凋亡［3］。Lirdprapamongkol等［4］新近报道：中药蜂胶主要活性成分白杨素抑制STAT3磷酸化下调Mcl-1敏化TRAIL诱导人癌细胞系A549和HeLa细胞凋亡。据此，在本文中，我们主要研究白杨素能否增强辐射诱导具干细胞样细胞特性宫颈癌HeLa细胞系SFCs凋亡作用［2］，并探讨其作用机制是否涉及调控STAT3活性。

1　资料与方法

1.1细胞与细胞培养 人宫颈癌细胞系HeLa细胞购自中国科学院上海生物化学和细胞生物研究所（中国上海市）。细胞用添加10%胎牛血清的DMEM培养基培养。

1.2肿瘤球形成试验 参照文献［5］方法获得人宫颈癌HeLa细胞系SFCs。简言之，用添加100 IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、20 ng/mL人重组表皮生长因子（hrEGF）、10 ng/mL人重组碱性成纤维细胞生长因子（hrbFGF）、不含维生素A的2% wt/vol B27 以及 1% wt/vol N2添加物（美国Invitrogen公司）的无血清DMEM/ F12培养基悬浮收集细胞。以10000细胞/孔的密度接种于超低粘附6孔板（美国Corning In公司）。每3天添加1次上述等量的生长因子。培养6天，在Nikon Eclipse TE2000-S显微镜下计数肿瘤球数，并照相。

1.3辐射处理 取人宫颈癌HeLa细胞系细胞和SFCs或用20.0μmol/L白杨素或含0.1% DMSO 干细胞培养基处理24 h的细胞，T-1000型钴60照射仪（美国Theratronic International公司）以每分钟1.1 Gy γ-射线放射量（发射源到6孔细胞培养板表面距离= 57.5 cm）暴露细胞在不同放射剂量（0、2、4、8和16 Gy）下。孵育细胞24 h，然后，测定DNA/组蛋白碎片水平。

1.4DNA/组蛋白碎片水平检测 取上述处理细胞，按照先前文献［6］描述的方法和步骤，采用细胞凋亡检测ELISA试剂盒（美国罗氏公司）测定细胞DNA/组蛋白碎片水平。

1.5Wester blot分析 按先前文献［6］描述完成蛋白印迹分析。抗p-STAT3、抗STAT3（美国Cell Signaling Technology公司）和抗β-actin抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司）用作一抗。细胞在4℃条件下，用裂解液孵育20 min裂解。Bio-Rad含量测定系统测定蛋白浓度。总蛋白经SDS-PAGE分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF，美国Millipore公司）上。用ECL高级蛋白印迹分析系统（美国Amersham Pharmacia Biotech司）检测信号。

1.6统计学分析 使用SPSS20.0 软件包（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）建立数据库。数据以均数±标准差表示。多组均数通过单因素方差分析进行比较，确认方差齐性，使用LSD法进行組与组之间均数比较。P＜0.05表示有统计学意义。

2　结果

2.1宫颈癌HeLa细胞系SFCs培养 干细胞条件培养基超低粘附板悬浮培养HeLa细胞系细胞6天，形成悬浮生长克隆性三维细胞球体（图1）。

图1　宫颈癌HeLa细胞系肿瘤球相差显微图像（×10）

2.2辐射诱导宫颈癌HeLa细胞系SFCs和亲本细胞凋亡的比较 用细胞凋亡ELISA检测试剂盒对比测定不同辐射剂量（2、4、8和16 Gy）诱导人宫颈癌HeLa细胞系SFCs和亲本细胞DNA/组蛋白碎片水平。结果证实，HeLa细胞系SFCs具有放疗耐受性（图2）。

图2　宫颈癌HeLa细胞系球形成细胞耐受辐射诱导细胞凋亡与相同剂量γ-射线HeLa细胞系细胞比较，*P＜0.05。PCs∶HeLa细胞系细胞。SFCs∶HeLa细胞系球形成细胞。

2.3白杨素与辐射联合处理对HeLa细胞系SFCs凋亡的影响 用细胞凋亡ELISA检测试剂盒测定20.0μmol/L白杨素及与不同辐射剂量（2、4、8和16 Gy）联合处理SFCs细胞DNA/组蛋白碎片水平。结果发现，20.0μmol/L白杨素增强辐射诱导SFCs凋亡作用（图3）。

图3　白杨素对辐射（IR）诱导宫颈癌HeLa细胞球形成细胞凋亡的影响与相同剂量γ-射线单独照射HeLa细胞系球形成细胞比较，*P＜0.05。

2.4白杨素对HeLa细胞系SFCs p-STAT3蛋白表达的影响 Western blot分析结果表明，人宫颈癌HeLa细胞系SFCs STAT3组成性活化表现为p-STAT3高表达；此外，20.0μmol/L白杨素显著下调SFCs细胞和亲本细胞p-STAT3蛋白表达（图4）。

图4　白杨素（chrysin）下调HeLa细胞系球形成细胞和亲本细胞p-STAT3蛋白表达作用的比较PCs∶HeLa细胞系细胞。SFCs∶HeLa细胞系球形成细胞。

3　讨论

临床上对宫颈癌的治疗迄今采用手术、放疗和化疗方案，主要通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥治疗效果［7］。本文实验研究的结果与López等［2］发表的研究结果一致，我们再次证实，与体外培养人宫颈癌HeLa细胞系细胞比较，SFCs具有耐受辐射诱导细胞凋亡性质；说明：宫颈癌干细胞样细胞的存在是其耐受放射治疗的主要原因。因此，寻求增强宫颈癌干细胞样细胞放疗敏感性的药物和探讨宫颈癌干细胞样细胞放疗放疗增敏机制对于改善临床宫颈癌的治疗效果显得尤为重要。

新近大量的研究提供证据表明，STAT3组成性激活参与和促成肿瘤干细胞放化疗耐受［8，9］。依据新近的报道：中药蜂胶主要活性成分白杨素抑制STAT3磷酸化下调Mcl-1敏化TRAIL诱导人癌细胞系A549和HeLa细胞凋亡［4］；本文首先观察白杨素能否增强辐射诱导宫颈癌干细胞样细胞凋亡作用，其次，我们探寻这些作用是否涉及白杨素抑制宫颈癌干细胞样细胞STAT3磷酸化。正如预期的那样，我们的实验研究结果首次证实：无细胞毒性浓度白杨素（20. 0μmol/L）与辐射协同诱导人宫颈癌HeLa细胞系SFCs凋亡，其作用与降低STAT3磷酸化水平相关。从而彰显了白杨素作为靶向宫颈癌干细胞样细胞，增强放疗敏感性的优良药效学特性。

［1］ Gadducci A， Tana R， Cosio S， Cionini L. Treatment options in recurrent cervical cancer （Review）［J］. Oncol Lett， 2010， 1（1）: 3-11.

［2］ López J， Poitevin A， Mendoza-Martínez V， et al. Cancer-initiating cells derived from established cervical cell lines exhibit stem-cell markers and increased radioresistance［J］. BMC Cancer， 2012， 12: 48.

［3］ Chen YW， Chen KH， Huang PI， et al. Cucurbitacin I suppressed stemlike property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44（+）ALDH1（+） cells［J］. Mol Cancer Ther， 2010， 9（11）: 2879-2892.

［4］ Lirdprapamongkol K， Sakurai H， Abdelhamed S， et al. Chrysin overcomes TRAIL resistance of cancer cells through Mcl-1 downregulation by inhibiting STAT3 phosphorylation［J］. Int J Oncol， 2013， 43（1）: 329-337.

［5］ 王雪莉， 曹晓诚， 盛习锋， 等. 紫花牡荆素对宫颈癌HeLa细胞系干细胞样细胞自我更新的影响［J］. 湖南师范大学学报（医学版），2013， 10（3）: 11-14.

［6］ 周蓓， 肖立红， 肖荞， 等. 8-溴-7-甲氧基白杨素对Huh-7细胞系肝癌干细胞样细胞自我更新的影响［J］. 湖南师范大学学报（医学版），2013， 10（1）: 10-14.

［7］ Liu YG， Zheng XL， Liu FM. The mechanism and inhibitory effect of recombinant human P53 adenovirus injection combined with paclitaxel on human cervical cancer cell HeLa［J］. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2015， 19（6）: 1037-1042.

［8］ Kim E， Kim M， Woo DH， et al. Phosphorylation of EZH2 activates STAT3 signaling via STAT3 methylation and promotes tumorigenicity of glioblastoma stem-like cells［J］. Cancer Cell， 2013， 23（6）: 839-852.

［9］ Chung SS， Aroh C， Vadgama JV. Constitutive activation of STAT3 signaling regulates hTERT and promotes stem cell-like traits in human breast cancer cells［J］. PLoS One， 2013， 8（12）: e83971.

Chrysin enhance radiation-induced apoptosis of sphere-forming cells from cervical cancer Hela cell line

Zhou Ting-fang1， Li Gao-feng， Li Duo2， Cui Ying-hong2， Yang Xiao-hong2， Cao Jian-guo2， Luo Qiong2
（1. Department of Oncology， Center Hospital of Zhuzhou， Zhuzou 412001， China； 2. Department of Pharmaceutical Science， Medical College，Hunan Normal University， Changsha 410013， China）

Objective To investigate the radiotherapy sensitization effect of chrysin on sphere forming cells （SFCs） from cervical cancer Hela cell line. Methods SFCs derived from cervical cancer Hela cell line were obtained and amplified by suspended culture method with stem cell-conditioned medium. And radiation-induced apoptosis of SFCs and parental cells was detected using DNA/histone enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. The p-STAT3 protein expression of SFCs and parental cells was analyzed by western bolt. Results Compared with parental cells， SFCs from Hela cell line were more resistant to radiation-induced apoptosis. Chrysin （20.0μmol/L） increased radiation-induced apoptosis and decreased p-STAT3 expression in SFCs. Conclusion The effect that chrysin enhances radiation-induced apoptosis in SFCs of cervical cancer Hela cell line was involved in inhibiting STAT3 activity by chrysin.

cervical cancer； radiotherapy； cancer stem cells； apoptosis； STAT3

R734.2

A

1673-016X（2015）03-0001-03

2015-01-18

国家自然科学基金面上项目（No. 81172375）

罗琼，E-Mail: 2233174557@qq.com