敖敦格日乐，杨体强，包斯琴高娃，石磊

（1.内蒙古医科大学计算机信息学院，内蒙古呼和浩特010110；2.内蒙古大学物理科学与技术学院，内蒙古呼和浩特010021；3.内蒙古工业大学理学院，内蒙古呼和浩特010051）

电场对脂肪酶二级结构及其活性的影响

敖敦格日乐1，杨体强2，包斯琴高娃3，石磊1

（1.内蒙古医科大学计算机信息学院，内蒙古呼和浩特010110；2.内蒙古大学物理科学与技术学院，内蒙古呼和浩特010021；3.内蒙古工业大学理学院，内蒙古呼和浩特010051）

脂肪酶被不同强度的电场处理5 min，用红外光谱法研究电场对其二级结构的影响，并测定酶活性的变化。实验结果显示：在1.0～6.0 kV/cm范围，电场作用对脂肪酶二级结构单元相对含量的影响程度不同。与对照组相比，处理组的α-螺旋和β-折叠含量普遍减少，减少幅度分别为4.9%～10.9%和3.2%～22.6%；β-转角和无规卷曲含量普遍增加，增加幅度分别为12.5%～37.7%和3.1%～24%。并且各种结构的含量在3.0 kV/cm电场强度条件下变化最为明显。经电场处理后脂肪酶活性显著增加，这与β-转角和无规卷曲含量的增加有一定的相关性。

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3）是一种单纯蛋白酶，它广泛存在于各种微生物、植物和动物体中。脂肪酶能催化天然油脂（甘油三脂）水解，反应过程中甘油三酯经甘油二酯、单酸甘油酯最终降解为甘油和脂肪酸，是一类特殊的酯键水解酶。脂肪酶作为生物催化剂可催化由不同底物出发的水解和合成反应，且反应不需要辅酶，反应条件温和，副产物少。脂肪酶由于其多重催化功能被广泛应用于食品工业中，如在奶制品的生产、烘焙食品的制作、油脂加工、酒类酿造、肉类加工及食品添加剂的生产等［1-4］。

脂肪酶的催化特性与其分子空间结构有着密切的联系。理论研究表明，酶蛋白质的空间结构对酶的功能至关重要，即使极其细微的扰乱，也能够极大地影响酶的活性。而且，蛋白质不是刚性分子，它的功能依赖于结构的这种运动性［5］。已有研究表明，电场处理可使酶的活性发生改变［6-8］，并提出酶活性发生变化的机制可能是电场处理导致酶的静电性质和构象发生改变［9-10］。

作者所在课题组应用不同电场强度条件处理脂肪酶，并利用FTIR光谱法研究了脂肪酶对照组和处理组二级结构含量变化，同时测定了酶活性。初步探讨了电场对酶分子结构和活性的作用机理，并拟为脂肪酶催化功能强化提出新的物理方法。

1　材料与方法

1.1材料

麦芽脂肪酶，比活力为10 U/mg，购自美国Sigma公司。

1.2实验方法

1.2.1样品的电场处理电场处理装置由平板电极形成，极板电压波形为50 Hz半波整流。实验中分别取等量脂肪酶样品经电场处理，电场处理条件分别为E=1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 kV/cm，共6个场强处理条件，对照组记为E0=0.0 kV/cm。电场处理时间5 min。

1.2.2红外光谱测试方法红外光谱测定采用NexusTM670傅立叶变换红外光谱仪（Nicolet公司制）。经不同强度电场处理后的脂肪酶，干燥保存12 h后，与KBr粉末按1∶100的质量比均匀混合，取等量压片进行红外光谱测定。红外光谱测试范围为400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，经32次扫描获得红外图谱。

2　实验结果

2.1电场对脂肪酶红外图谱的影响

图1为脂肪酶酰胺Ⅰ带的去卷积谱。对照组在酰胺Ⅰ存在8个子峰，分别为1 691、1 678、1 668、1 656、1 648、1 638、1 629 cm-1和1 620 cm-1。与对照组相比，不同电场强度处理对脂肪酶去卷积谱子峰峰位和峰强有不同影响：经电场处理后，脂肪酶酰胺Ⅰ带表现为9个子峰，1 678 cm-1峰红移至1672cm-1，1668cm-1蓝移至1663cm-1，且在1682 cm-1附近有新增子峰；1 638、1 629 cm-1和1 691 cm-1处子峰相对强度明显下降。

1.2.3光谱处理用仪器自带的OMNIC E.S.P.5.1软件包对所得红外光谱酰胺Ⅰ带进行两点基线校正，并进行7点Savitsk-Golay函数平滑处理，再作二阶导数和傅立叶去卷积谱，控制半峰全宽（Band width）18，增强因子（Enhancement factor）2.3。结合二阶导数谱和去卷积谱得到的子峰峰位进行相应的二级结构谱峰指认。根据各子峰的吸收频率，利用Microsft origin数学软件对谱图进行高斯曲线拟合。拟合过程中进行基线校正，多次拟合使残差最小。

1.2.4活性的测定活性的测定按参考文献方法［11］进行。脂肪酶水解油酯为油及游离脂肪酸，用酸碱滴定法滴定生成游离脂肪酸以测定脂肪酶活性。

图1　不同电场强度处理对脂肪酶酰胺Ⅰ带去卷积谱图的影响Fig.1Effects of electric strength on the deconvolved spectra in the amideⅠregion of lipase

2.2电场对脂肪酶二级结构的影响

按文献报道［12-15］，结合二阶导数谱，可将脂肪酶酰胺Ⅰ带各子峰归属不同二级结构：（1 656±2）cm-1峰归属为琢-螺旋结构；（1 639±2）、（1 629±2）、（1 620±2）cm-1和（1 691±4）cm-1峰归属为茁-折叠结构；（1 678±2）、（1 667±2）、（1 682±2）cm-1峰归属为茁-转角结构；（1 646±3）cm-1峰归属为无规卷曲结构。从各子峰的相对强度和面积分数估计，脂肪酶二级结构应以茁-折叠结构为主。这与已有报道较为一致［16-17］。

从脂肪酶去卷积谱的变化情况可以看出，电场处理后脂肪酶的琢-螺旋、茁-折叠的特征峰相对强度均降低，表明其结构含量也降低。在1 682 cm-1附近有新增子峰，表明茁-转角结构含量明显增加。1 647 cm-1峰相对强度增加，表明无规卷曲结构含量的增加。对酰胺Ⅰ带去卷积谱进行曲线拟合，计算出各电场处理条件下脂肪酶二级结构含量，如表1所示。

表1　不同电场强度处理后的脂肪酶二级结构含量Table 1Contents of secondary structures of lipase treated by electric field with different strength

图2是脂肪酶在不同电场强度下各二级结构含量相对对照组的变化。与对照组相比，电场处理后：

1）琢-螺旋含量降低，降幅在4.9%～10.9%，并且随着电场强度增加，其降幅不同，在1.0、6.0 kV/cm和3.0 kV/cm时降幅较大。

2）茁-折叠含量有不同程度减少，降幅在3.2%～22.6%，其中场强为3.0 kV/cm时降幅最大，6.0 kV/ cm时降幅最小。

3）茁-转角含量大幅度增加，增幅在12.5%～37.7%，其中场强3.0 kV/cm时增幅最大，6.0 kV/cm时增幅最小。

4）电场的作用使无规卷曲含量不同程度的增加，增幅在3.1%～24%，其中以3.0 kV/cm时增幅最大，6.0 kV/cm时增幅最小。

图2　不同电场强度下脂肪酶二级结构相对变化量Fig.2Relative change of secondary structure content of lipase treated with electric field of different strength

总体而言，脂肪酶经不同电场强度处理后，其二级结构各单元面积分数有不同程度的变化，且其变化规律呈非单调型变化。电场具有使脂肪酶的二级结构由α-螺旋、β-折叠向β-转角、无规卷曲转化的作用。这与CD光谱法研究的结果一致［18］。

2.3脂肪酶二级结构与活性变化关系

脂肪酶经不同强度电场处理后，其活性有不同程度的变化。图3是处理组相对对照组脂肪酶活性的变化规律。可以看出，经不同电场强度处理后脂肪酶活性都有较大幅度增加，并在3.0 kV/cm和4.0 kV/cm电场强度条件时活性增加幅度较大。

图3　不同电场强度下脂肪酶活性的相对变化量Fig.3Relative change of lipase activity treated with electric field of different strength

电场处理后脂肪酶相对活性的增加与其二级结构含量的变化有一定的相关性。随着电场强度的增加，α-螺旋和β-折叠结构的含量变化规律与脂肪酶活性的变化规律呈负相关，而β-转角和无规卷曲含量变化与酶活性呈正相关。并且在3.0 kV/cm场强条件时，脂肪酶结构含量和活性均出现了明显的变化。

3　讨论

蛋白质的二级结构是指多肽链骨架中局部肽段的构象。α-螺旋和β-折叠结构中存在较多的氢键，其作用使得规则二级结构具有一定的稳定性和刚性。无规卷曲中氢键只有很弱的作用，使肽段中的各个残基间有更大的自由度，从而表现出极大的柔性。蛋白质分子中α-螺旋和β-折叠的稳定性主要取决于分子内部的氢键。电场作用导致脂肪酶二级结构中α-螺旋与β-折叠含量减少，β-转角和无规卷曲含量增加。这表明电场的作用影响了脂肪酶蛋白质分子内部的电荷分布，使原有维系其螺旋和折叠结构稳定性的氢键取向发生改变，稳定性降低，柔性加大。除此以外，脂肪酶的催化活性中心是由Ser-His-Asp/Glu组成的催化三联体结构构成，而催化部位被埋在分子中，表面被对它们起保护作用的α-螺旋盖状结构覆盖。脂肪酶“盖子”结构不仅影响酶活性，而且影响酶底物的特异性和稳定性。电场作用可能导致了脂肪酶二级结构中α-螺旋盖状结构被打开，将活性中心暴露出来，从而底物能够更靠近活性中心，催化过程得以进行。

4　结语

目前，人们对生物大分子的电磁效应研究较为普遍。然而，由于生物大分子的结构和功能的特异性，对其处理条件、剂量和时效性的研究仍存在不同的意见。作者研究结果表明，50 Hz高压电场处理脂肪酶5 min，具有使脂肪酶的二级结构由α－螺旋、β－折叠向β－转角、无规卷曲转化的作用，且对不同结构含量和活性的影响均呈非单调性变化。脂肪酶在3.0 kV/cm场强处理条件下表现出其结构含量和活性变化幅度较大。这说明3.0 kV/cm电场强度处理条件对脂肪酶催化功能起到了较好的促进作用。因此3.0 kV/cm电场强度可作为最佳处理条件。电场处理对蛋白酶时效性的影响还有待于进一步深入研究。

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Study on the Effect of Electric Field on the Secondary Structure and Activity of Lipase

AO Dungerile1，YANG Tiqiang2，BAO Siqingaowa3，SHI Lei1
（1.School of Computer and Information，Inner Mongolia Medical University，Huhhot 010110，China；2.School of Physical Science and Technology，Inner Mongolia University，Huhhot 010021，China；3.School of Science，Inner Mongolia University of Technology，Huhhot 010051，China）

The changes in the secondary structures and activity of lipase after 5 min treatment using electric field with different strength were studied by FTIR（Fourier-transformation infrared spectroscopy）.The effect of electric field on the relative contents of the lipase secondary structures，i.e.α-helix，β-sheet，β-turn and random coil，varied within the range of 1.0 kV/cm to 6.0 kV/cm. Compared with the control groups，the relative contents of α-helix and β-sheet both decreased，namely，4.9%～10.9%for α-helix and 3.2%～22.6%for β-sheet respectively.The relative contents of β-turn and random coil increased instead，namely，12.5%～37.7%for β-turn and 3.1%～24%for random coil respectively.The most significant change of the relative contents for different secondary structure was observed at the 3.0 kV/cm electric field，which suggested the lipase activity was greatly improved after treatment by electric field.The improvement of the activity was related to the content increase of β-turn and random coil.

electric field，lipase，FTIR，secondary structure，activity

Q 683

A

1673—1689（2015）12—1256—06

2014-10-09

国家自然科学基金项目（30260028）；内蒙古自治区重大科技项目（200508010101）。

敖敦格日乐（1980—），女，蒙古族，内蒙古通辽人，理学硕士，讲师，主要从事生物物理学研究。E-mail：adgrl@163.com

主题词：电场；脂肪酶；红外光谱；二级结构；酶活性