西安市第四医院麻醉科 (西安 710004)　雷安锋　段　晶　陈　燕　彭春晓　王秋月



右美托咪啶对脂多糖致伤大鼠肾小管上皮细胞TLR4表达的影响*

西安市第四医院麻醉科 (西安 710004)雷安锋段晶陈燕彭春晓王秋月▲

目的：观察右美托咪啶对脂多糖致伤大鼠肾小管上皮细胞TLR4表达影响，探讨其可能机制。方法: 将大鼠肾小管上皮细胞复苏后培养，加入10ng/ml脂多糖(LPS)，均经培养后分为3组，A组为空白对照组，B组为对照组，加入右美托咪定2.5μg，C组为实验组，先加入阿替美唑10μg后30min加入右美托咪定2.5μg，培养12h，免疫组化法检测TLR4蛋白表达及TLR4mRNA水平，并测定细胞凋亡率。结果：B组应用右美托咪定后，TLR4水平为(45.1±13.5)×103均低于A组、B组(tBA=6.549，tBC=5.660，P<0.05)；B组TLR4mRNA相对表达值为0.46±0.02，均低于A组、C组(tBA=27.599,tBC=24.749,P<0.05)。B组使用右美托咪定后，细胞凋亡率为(34.6±7.6)%，均明显低于A组、C组(P<0.05)。结论:右美托咪啶可下调脂多糖致伤大鼠肾小管上皮细胞TLR4表达，且右美托咪啶对TLR4的调节与α2AR被激动相关。

KEY WORDSKidney diseases/chemicalinducedLipopolysaccharidesDexmedetomidine/therapeutic useEpithelial cells/metabolismAnimals,laboratoryRats@TLR4

资料与方法

1主要试剂大鼠肾小管上皮细胞(XX细胞库)；脂多糖(LPS 批号：L2880，天津灏洋生物制品有限公司)；右美托咪定(批号:09081232江苏恒瑞医药股份有限公司)；ELISA试剂盒(北京科美东雅生物技术有限公司)；PTPCR试剂(大连宝生物工程有限公司)；引物合成(伤害生工生物工程技术服务有限公司)；PCR扩增仪(美国PE公司)

2研究方法复苏细胞后，接种于50ml玻璃瓶中，于MEM培养基中行常规培养，MEM培养基含10%胎牛血清、100U/ml青霉+100U/ ml链霉素等，置入37°C、5%CO2饱和湿度的恒温培养箱，并于每1～2h更换培养基；待细胞长成致密单层后，使用0.25%胰蛋白酶消化，按1×105浓度接种于24孔板中，使细胞贴壁生长18～24h。然后加入LPS(10ng/ml)培养12h。然后随机分为3组，每组10个。

2.1处理方法：A组空白对照组。B组对照组，加入右美托咪定2.5μg，C组实验组，先加入阿替美唑10μg后30min加入右美托咪定2.5μg。3组均继续培养12h。

2.2TLR4水平及TLR4mRNA水平测定 ：①采取免疫组化方式测定肾脏组织TLR4水平。②测定TLR4mRNA水平：严格按照试剂说明进行，TLR4上游引物：5’-GTCCATCGGTTGATCTTGGGA-3’，下游引物为：5’-AGAATTGCCAGCCATTTTTAA-3’,扩增片段长度为681bp。β-action为内参，其上游引物为：5’-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3’,下游引物为：5’-AGAGGTCTTTACGGATGTCAAACC-3’,扩增片段长度为281bp。PCR反应体系反应条件：94℃环境下变性5min，然后按照94℃30s、51℃40s、72℃60s，行扩增30个循环，最后于72℃下延伸5min。最后取各组样本产物5μl，与溴酚蓝载样缓冲液1μl一起加入1.5%琼脂糖凝聚样品孔中，70V恒压电泳20min，使用DH2000凝胶图像分析系统进行分析，TLR4mRNA灰度值与β-action灰度值比值作为TLR4mRNA表达水平。

2.3细胞凋亡检测：使用PBS洗涤细胞，吸取含细胞平衡液100μl至离心管，加入5μl Annexin V-FITC及5μl PI,避光室温反应15min，加入400μl平衡液于流式细胞仪上检测。

3观察指标①肾脏组织TLR4水平差异；②TLR4mRNA水平；③细胞凋亡率。

结　果

1三组大鼠肾脏组织TLR4水平及TLR4mRNA水平比较见表1。B组应用右美托咪定后，TLR4水平及TLR4mRNA为(45.1±13.5)×103、(0.46±0.02)均低于A组、C组(P<0.05)。

2三组大鼠肾脏组织细胞凋亡率比较见表2。

表1　 三组大鼠肾脏组织TLR4RTLR4 mRNA水平比较

表2　 三组大鼠肾脏组织细胞凋亡率比较(%)

B组使用右美托咪定后，细胞凋亡率为(34.6±7.6)%，均明显低于A组、C组(P<0.05)。

讨　论

研究[1]表明：急性肾损伤(AKI)为脓毒血症并发症之一，是各种原因所致机体肾功能在几小时至几天内突然下降的综合征。研究[2]表明：约50%脓毒症患者发生AKI，死亡率高达60%。

右美托咪啶(Dexmedetomidine,Dex)为新型高选择性α肾上腺素能受体(α2adrenogic recptor,α2AR)激动剂，其机制为通过激动中枢神经系统α2A最密集的区域-脑干蓝斑引发并维持自然非动眼睡眠状态，产生镇静、催眠作用。Dex还具有镇痛、稳定血流动力学和利尿的效应，可用于ICU患者的镇痛，而且有研究[3]表明：Dex对脓毒症大鼠的肾功能具有一定的保护作用,减少肾衰竭的发生。动物实验[4]表明：脓毒症大鼠体内LPS与肾脏TLR4结合，激活TLR4信号传导通路，导致IκB从IκB/ NF-κB复合物释放，NF-κB活化转位进核，使信号下游致炎因子TNF-α，IL-1B和IL-6增多导致急性肾损伤。Dex降低脓毒症大鼠血清TNF-α，IL-1B和IL-6。所以防治脓毒症导致的急性肾损伤可以通过下调TLR4的表达或抑制TLR4信号通路控制炎性反应对肾脏损伤。而Dex可降低脓毒症大鼠肾小管上皮细胞TLR4表达，达到肾脏保护作用。本研究结果表明：肾小管上皮细胞TLR4表达水平明显低于A组，可见右美托咪定可下调肾小管上皮细胞TLR4表达，保护肾脏；而C组应用α2AR受体阻滞剂再应用右美托咪定，结果发现改组TLR4表达、TLR4mRNA及细胞凋亡均低于B组，可见右美托咪定下调TLR4表达发挥肾脏保护作用与α2AR受体激动有关。

[1]蔡玥娇,刘华跃,钟丽敏.右美托咪定对脓毒症大鼠脑组织炎性反应的影响[J].中华麻醉学杂志,2013,33(6):749-751.

[2]何许伟,邱泽亮,楼天正.间歇性高容量血液滤过对严重脓毒症患者Toll样受体4的影响[J].中国医师杂志,2013,7(1):58-60.

[3]Kumpf O，Giamarellos-Bourboulis EJ，Koch A，etal. Influenceof genetic variations in TLR4 and TIRAP/Mal on the course ofsepsis and pneumonia and cytokine release:an observationalstudy in three cohorts[J].Crit Care,2010，14(3):103-113.

[4]付朝晖,姚尚龙,袁世荧.盐酸戊乙奎醚对脓毒症致大鼠急性肺损伤时Toll样受体4及NF-κB表达的影响[J].中华麻醉学杂志,2013,33(9):1134-1137.

(收稿：2015-03-20)

The influence of Toll receptor 4 in renal tubular epithelial cells of dexmedetomidine on rat injured by lipopolysaccharide

Department of Anesthesiology,The 4th Xi’an Hospital(Xi’an 710004)

Lei AnfengDuan JingChen Yanet al

Objective: To observe the effect of dexmedetomidine for Toll receptor 4 in renal tubular epithelial cells on rat injured by lipopolysaccharide,and explore the possible mechanism.Methods：Rat renal tubular epithelial cells and recovery, training,then they were added 10 ng/ml lipopolysaccharide(LPS)to culture and divided into A group(blank control group), group B(control group) was added 2.5 μg dexmedetomidine, group C (experimental group)was joined the 10μg atipamezole,2.5 μg dexmedetomidine after 30min, developing 12h,then took immunohistochemistry to measure expression of TLR4protein and TLR4mRNA, and determine the apoptosis rate of them. Results：Toll receptor 4 level was (45.1 ± 13.5) × 103in group B adopted dexmedetomidine and was lower than those of A and B group,(tBA=6.549，tBC=5.660，P<0.05)，B group’ TLR4mRNA was (0.46 ± 0.02)and lower than those of A and C group,(tBA=27.599，tBC=24.749，P<0.05).The apoptosis rate of group B was (34.6±7.6)% and significantly lower than that in A and C group(P<0.05).Conclusion： Dexmedetomidine can down Toll receptor 4 expression in renal tubular epithelial cells of rat injured by lipopolysaccharide, and the regulation for TLR4 of dexmedetomidine is related with α 2AR excited.

中国医科大学附属第一医院内分泌科

R631.2

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2015.09.003

﹡辽宁省科技攻关计划项目(2011225017)

主题词肾疾病/化学诱导脂多糖类右美托咪啶/治疗应用上皮细胞/代谢动物，实验大鼠@TLR4