李晶，张树良，赵冬梅

（天津市红桥区产品质量监督检验所，天津300122）

发酵法制取大豆染料木素的研究

李晶，张树良，赵冬梅

（天津市红桥区产品质量监督检验所，天津300122）

通过单因素和正交试验确定，得出纳豆芽孢杆菌A-3发酵豆粕产染料木素的最佳条件为8%豆粕添加量，培养温度为34℃，转速为180 r/min，培养64 h，pH为7.3，装液量为50 mL/250 mL，接菌量为10%。最终目的产物染料木素的产率为0.12%，转化率为89.13%，达到理想水平。

豆粕；发酵；染料木素；培养条件

大豆异黄酮是黄酮类化合物，是大豆生长中形成的一类次级代谢产物，是一种生物活性物质。大豆异黄酮含有九种葡糖苷和三种苷元，染料木素是其中活性功能最高的一种苷元成分，具有雌性激素及抗雌激素性质、抗氧化作用，可以抑制酪氨酸蛋白激酶（PTK）的活性，也可以抑制拓扑异购酶Ⅱ的活性，具有诱发细胞程序性死亡、提高抗癌药效、抑制血管生成等作用，是一种很有潜力的癌症化学预防剂，其抗癌作用及机制具有广泛的应用前景。

染料木苷在生物酶的作用下脱去一个葡萄糖形成染料木素，纳豆芽胞杆菌分泌的β-葡萄糖苷酶就具有同样的作用。本试验通过液质联用方法测定，得出纳豆芽孢杆菌A-3发酵豆粕在最佳条件下，染料木素的产率和转化率明显提高。

1材料与方法

1.1菌种

纳豆菌A（BacillusnattoA）、纳豆菌B（BacillusnattoB）。

1.2培养基

1.2.1种子培养基

葡萄糖3%，大豆蛋白胨2%，pH7.2～7.4，NaCl1%。

1.2.2斜面培养基

牛肉膏0.5%，大豆蛋白胨0.5%，琼脂2%，pH7.2～7.4，NaCl 0.5%。

1.2.3发酵产酶培养基

葡萄糖2%，大豆蛋白胨2%，NaCl 1%，MgSO40.05%，CaCl20.01%，pH 7.2～7.4。

1.3仪器与主要原料

全温振荡器（型号HZQ-QX）：哈尔滨东联电子技术开发有限公司；高温高压灭菌锅（型号：MLS-3750）：SANYO Electric Co.，Ltd；三频数控超声波清洗器（型号：KQ-200VDV）：昆山市超声仪器有限公司；液质联用仪（型号：Xevo-TQD）：美国沃特斯公司；高效液相色谱仪（型号：Agilent1260）：美国安捷伦公司；脱脂豆粕：天津实发冠华生物科技有限公司提供。

1.4菌种筛选

1.4.1菌种纯化

挑取纳豆菌A和B各一环，分别溶于10 mL无菌水内，配成10-1菌悬液，再逐步稀释成10-3～10-4的菌悬液，取0.1 mL涂于平板培养24 h。

1.4.2菌种初筛

将纳豆菌A和B从平板中分离的20株菌转接种子培养基34℃培养，24 h后接入发酵产酶培养基进行酶活初测，接种量为10%，利用水杨苷法测定酶活，方法参照葡萄糖苷酶产生菌发酵条件的优化、粗分离及其特征，选出酶活较高的菌株。

1.4.3产酶条件优化

通过对pH、装液量、温度、转速、发酵时间等因素的选择来优化菌的产酶条件。

1.4.4菌种驯化

制定三级驯化方案。将发酵产酶培养基中的大豆蛋白胨用豆粕替代，替代量分别为2%、4%和6%，将筛选出来的菌株进行逐级驯化，保存于斜面培养基。

1.5发酵培养

将驯化后的菌株转接至豆粕培养基进行液体深层发酵，通过控制pH、装液量、温度、转速、发酵时间等因素，确定最佳的发酵方案，通过喷雾干燥将发酵液制成粉末，使最终目的产物染料木素产率达到理想值。

1.6测定方法

样品和标准品均用80%乙醇溶解，料∶液=1∶15，超声波提取2次，20 min/次，45 Hz，提取液定容到250 mL，再稀释一定浓度，进行0.45 μm过滤。由于样品含有其他与目的产品相近的物质，干扰大，杂峰多，因此本试验采用液质联用的方法，进一步确定染料木素的含量。

色谱条件：安捷伦C18柱（4.6 mmi.d.×250 mm，5 μm）；柱温30℃；0.04 mol乙酸胺（乙酸调pH4）∶甲醇=70∶30为流动相；检测波长260 nm；流速1 mL/min；进样量20 μL。

2结果与分析

2.1菌种的筛选结果

通过对Natto A和Natto B两株菌的分离纯化，各挑选10株菌进行发酵液的酶活测定，测定结果见表1。

表1　酶活测定结果Table 1Enzyme activity assay results U/mL

从整体来看，Natto A比Natto B的产酶水平要高，其中最高的是Natto A-3，可以选择该菌进行下一步驯化。另外有个别酶活是负值，据记载是在测酶活过程中，吸光度出现了负值。

2.2纳豆菌生长曲线

将驯化后的Natto A-3接入种子培养基，装液量为50 mL/250 mL，在48 h内每隔4 h取样利用紫外分光光度计测定生物量，方法参照［纳豆菌液体发酵条件的初步研究］结果见图1。

图1　Natto A-3生长曲线Fig.1Growth curve of Natto A-3

纳豆菌从4 h开始进入对数期，到40h时倒到最大值，后进入平稳期。可见该菌株最佳发酵时间为40 h。

2.3产酶条件优化

2.3.1起始pH对产酶的影响

研究不同pH（7.2、7.3、7.4、7.5）采用产酶发酵培养基配方，其它发酵条件为转速140 r/min、发酵温度34℃、装液量为50 mL/250 mL、发酵时间为48 h对β-葡萄糖苷酶活力的影响，结果见图2。

图2　不同pH对β-葡萄糖苷酶活力的影响Fig.2Effect of different pH on the activity of β-glucosidase

由图2可知，最佳起始pH为7.3，酶活达到39.2 U/mL。

2.3.2不同的装液量对产酶的影响

研究不同装液量（20、30、40、50、60 mL）/250 mL采用产酶发酵培养基配方，其它发酵条件不变，对β-葡萄糖苷酶活力的影响，结果见图3。

图3　不同装液量对β-葡萄糖苷酶活力的影响Fig.3Effect of different liquid loading on the activity of β-glucosidase

由图3可知，最佳装液量为40 mL/250 mL三角瓶，酶活达到40.1 U/mL，装液量40 mL和50 mL时酶活相差不大，在实验中为了提高效率，可以选用50 mL的装液量。

2.3.3不同的发酵温度对产酶的影响

研究不同温度（28、32、37、40℃）采用产酶发酵培养基配方其它发酵条件不变，对β-葡萄糖苷酶活力的影响，结果见图4。

2.3.4不同的转速对产酶的影响

图4　不同培养温度对β-葡萄糖苷酶活力的影响Fig.4Effect of different cultivation temperature on the activity of β-glucosidase

研究不同转速（70、120、150、180 r/min）采用产酶发酵培养基配方，其它发酵条件不变，对β-葡萄糖苷酶活力的影响，结果见图5。

图5　不同转速对β-葡萄糖苷酶活力的影响Fig.5Effect of different rotation speed on the activity of β-glucosidase

由图5可知，转速为160 r/min时，菌株的产酶最高，为39.5 U/mL。纳豆菌为兼性好氧芽孢杆菌，由此可见，增大溶氧量对菌体产酶也有很大影响。

2.3.5发酵时间对产酶的影响

研究不同发酵时间（24、32、48、60、72 h）采用产酶发酵培养基配方，其它发酵条件不变，对β-葡萄糖苷酶活力的影响，结果见图6。

图6　不同发酵时间对β-葡萄糖苷酶活力的影响Fig.6Effect of different fermentation hours on the activity of β-glucosidase

由图6可知，发酵时间为60 h时，菌株产酶最高，为49.6 U/mL。

2.4正交试验结果与分析

通过一系列产酶条件优化，得出NattoA-3的单因素产酶条件，分别是pH为7.3，装液量为50mL/250mL，培养温度为34℃，转速160 r/min，发酵56 h。通过观察发现，转速和发酵时间与其他条件相比对产酶的影响稍显平稳，其他条件的变化反差较大基本可以确定。另外，豆粕的添加量也是影响染料木素产率的重要因素。为了最大限度使产率提高，本实验采取三因素三水平L9（33）正交试验确定最佳工艺条件。因素水平表见表2，结果分析表见表3。

表2　因素水平表Table 2Factor Level

表3　结果分析表Table 3Result Analysis

从表3结果分析表明，影响实验结果的主次顺序分别为C＞A＞B，最佳优化组合为A1B3C3，即8%豆粕添加量，180 r/min，培养64 h。从总体趋势来看，培养时间对染料木素的产率影响最大，在豆粕添加量相同的情况下，发酵时间越长，产率越高。

3讨论

通过单因素和正交试验确定，得出纳豆芽孢杆菌A-3发酵豆粕产染料木素的最佳条件为8%豆粕添加量，培养温度为34℃，转速为180 r/min，培养64 h，pH为7.3，装液量为50 mL/250 mL，接菌量为10%通过稳定性试验，目的产物染料木素的产率为0.12%，转化率为89.13%，达到理想水平。发酵法生产的大豆染料木素产品对异黄酮中的染料木苷等糖苷形式进行转化，提高了染料木素的含量，对大豆豆粕进行后续的加工延长整个产业链的关键环节，而且对大豆行业的发展起到了极其重要的促进作用，产业化前景十分良好。

［1］孙体健，王浩江，曹晓峰，等.发酵豆粕中大豆异黄酮的超声波提取工艺［J］.中国食品卫生杂志，2006，18（5）:418-420

［2］Matusuura M.β-Glucosidases from soybeans hydrolyze daidzin and genistin［J］.Food Science，1993，58（1）:144-147

［3］孙丽艳，崔洪斌，赵琪，等.发酵罐制备大豆异黄酮糖苷转化酶（β-糖苷酶）条件的研究［J］.大豆通报，2006，3:17-21

［4］孙艳，庄逢源.大豆异黄酮的微生物转化［J］.微生物学通报，2005，32（5）:147-150

［5］徐世芳，陈爱瑛.微胶囊大豆异黄酮有效成分的HPLC含量测定［J］.食品科学，2007，28（11）:473-475

Study on the Soybean Genistein by Fermentation Method

LI Jing，ZHANG Shu-liang，ZHAO Dong-mei
（Product Quality Supervision and Inspection Institute of Hongqiao District，Tianjin 300122，China）

The optimal conditions of producing genistein demonstrated by applying sigle factor and response surface methodology were that the concentration of soybean meal，rotation speed，fermentation hours the optimal pH were 8%，180 r/min，64 h，7.3，the liquid loading amount was 50 mL/250 mL，the bacteria amount was 10%.The yield of genistein ratio arrived at 0.12%，the conversion rate was 89.13%，which achieves the optimal level.

defatted soybean meal；fermentation genistein；fermentation conditions

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.019

2015-05-15

李晶（1969—），女（汉），工程师，本科，研究方向：食品检验技术。