杨国韬，兰 艳

（1. 黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院），湖北 黄石 435000； 2. 肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 黄石 435000）

高效液相色谱法研究甲氨蝶呤和特立氟胺在大鼠体内的药代动力学

杨国韬1，2，兰 艳1，2

（1. 黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院），湖北 黄石 435000； 2. 肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 黄石 435000）

采用高效液相色谱法（HPLC）建立大鼠血浆中的甲氨蝶呤（MTX）和特立氟胺（TEF）的检测方法，研究大鼠体内MTX和TEF的药代动力学。色谱柱为Aglient ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相：50 mM 乙酸钠溶液—乙腈（体积比85:15）；检测波长为300 nm；柱温为30 ℃；流速为1.5 mL/min。大鼠采用静脉注射给药，药动学参数采用DAS 2.0计算。该HPLC方法可用于大鼠血浆中MTX和TEF的同时测定，方法准确，快速，灵敏度高，重复性好，适用于大鼠体内MTX和TEF药物代谢动力学的研究。

高效液相色谱法；甲氨蝶呤；特立氟胺；大鼠；药代动力学

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性的多系统的具有侵蚀性的自身免疫性疾病，临床主要表现为对称性多关节炎，其症状多见关节肿痛、功能障碍、关节僵硬和畸形，最终可导致残疾。其发病机制尚不明确，严重威胁着人类健康［1，2］。目前，临床上经常采用甲氨蝶呤（MTX）和来氟米特（LEF）联合用药的方式来对RA进行治疗［3］。MTX为常用药物，不良反应较多，难以长时间持续使用，而来氟米特（LEF）是一种相对高效低毒的新型抗炎和免疫调节抗RA药物临床疗效显著［4］。本品为前药，其进入体内后在肠和肝中代谢成为活性产物特立氟胺（TEF），后者可抑制嘧啶核苷合成所需的二氢乳清酸脱氢酶。大多数研究都采用监测TEF的方法，来评价LEF疗效及作用特点［4］。因此本文选择MTX和TEF作为研究对象。

本文拟通过HPLC法建立大鼠血浆中MTX和TEF浓度检测方法，并探讨MTX和TEF在大鼠体内的药代动力学特点［5，6］。通过该研究可对进一步评价MTX和TEF联合应用治疗类风湿性关节炎的作用机理，对药物的安全应用具有重要意义。

1 实验部分

1.1 动物

普通级雄性SD大鼠6只，体质量（200±20）g，购自北京维通利华动物实验中心，实验动物合格证号为SCXK（京）2010-0016。

1.2 药品与试剂

甲氨蝶呤（浙江海正药业股份有限公司，国药准字H20055198）；特立氟胺（湖北恒绿源科技有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国Fisher Scientific公司）；乙酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；水为纯净水。

1.3 仪器

日立 L-7000型高效液相色谱系统，配有L-7110 型泵，L-7200 型自动进样器，L-7420 型UV检测器； Sigma 3K15 高速低温离心机（Sigma公司）；DCY-24S水浴式氮吹仪（青岛海科仪器有限公司）；BS110S型电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；XW-80A 旋涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；KQ 500DE型数控超声波清洁器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件

色谱柱为Aglient ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 µm）；流动相：50 mM 乙酸钠溶液—乙腈（体积比85:15）；检测波长为300 nm；柱温为30 ℃；流速为1.5 mL/min。

1.4.2 标准曲线的配制

精密秤取 MTX对照品适量，用稀盐酸溶解后加纯净水稀释至刻度，配制成400 µg/mL贮备液；精密秤取TEF对照品适量，用甲醇溶解并定容，配制成400 µg/mL贮备液。临用前将两个储备液等量混合，用甲醇逐级稀释，配制成MTX和TEF浓度均为2.0、5.0、10、20、100、和200 µg/mL的系列标准溶液。再分别取标准系列溶液10 µL加入到90 µL空白大鼠血浆中，使血浆中MTX和TEF浓度均为0.2、0.5、1.0、2.0、10、和20 µg/mL。配制过程注意避光。

1.4.3 血浆样品处理

取大鼠血浆样品0.1 mL，加入沉淀剂（乙腈：甲醇1∶1）0.6 mL，充分涡旋振荡1 min，1 4000 r/min离心10 min，取上清0.5 mL置1.5 mL离心管中，氮气吹干，取0.1 mL流动相复溶，进样50 µL进行分析。

1.4.4 大鼠药动学

6只雄性大鼠适应性饲养7 d，实验前一天至少禁食12 h，给药前将MTX和TEF混合，尾静脉注射给药。MTX和TEF的给药剂量分别为2 mg/kg和1 mg/kg。分别于给药前和给药后0.083、0.5、1、2、4、8、12和24 h眼球静脉丛取血0.3 mL置于肝素化的离心管中。3 000 r/min离心15 min，取血浆-30℃保存备用。

1.4.5 数据处理

采用DAS 2.0软件计算药代动力学参数，计数资料以mean ± SD表示， Origin 8.0绘制药物血浆浓度-时间曲线。

2 结果与讨论

2.1 方法学验证

在上述色谱条件下，MTX和TEF的保留时间分别为6.52 和8.75 min。空白血浆、空白血浆中加入MTX和TEF标准溶液及静注给药后大鼠血浆色谱图（图 1）表明在该色谱条件下，空白基质中的杂质不干扰MTX和TEF的测定。

以MTX浓度（X）为横坐标，MTX峰面积（Y）为纵坐标，做线性回归，得相应的回归方程 Y = 146.31X -119.65，r = 0. 9952，显示MTX血药浓度在0.2～20 µg/mL的范围内呈现良好的线性关系。定量下限为0.2 µg/mL。以TEF浓度（X）为横坐标，TEF峰面积（Y）为纵坐标，做线性回归，得相应的回归方程Y = 216.48X +88.32，r = 0. 9964，显示TEF血药浓度在0.2～20 µg/mL的范围内呈现良好的线性关系。定量下限为0.2 µg/mL。

低、中、高三个浓度MTX和TEF样品（0.2、2.0和20 µg/mL）的日内RSD和日间RSD均小于10%，回收率和准确度在85%～115%之间（表1和表2）。MTX和TEF样品在室温放置6 h和进样仓放置24 h条件下保持稳定（表3）。方法学验证结果显示该方法符合生物样品分析要求。

图1 大鼠血浆色谱图Fig.1 Chromatograms for rat plasma

表1 大鼠血浆中MTX测定方法的回收率、精密度和准确度Table 1 Recovery， precision and accuracy of the assay method for MTX in rat plasma （n= 5）

表2 大鼠血浆中TEF测定方法的回收率、精密度和准确度Table 2 Recovery， precision and accuracy of the assay method for TEF in rat plasma （n= 5）

表3 大鼠血浆中MTX和TEF的稳定性Table 3 Stability of MTX and TEF in rat plasma （mean±SD，n=5）

2.2 大鼠药动学

大鼠尾静脉注射MTX和TEF后的药物血浆浓度-时间曲线和主要的药代动力学参数分别见图 2和表4。

表4 大鼠静注MTX和TEF后的主要药代动力学参数Table 4 Pharmacokinetic parameters of MTX and TEF after iv administration in rats （mean ± SD， n=6）

3 结 论

本文建立的HPLC方法准确，快速，灵敏度高，重复性好，能够对大鼠血浆中MTX和TEF的浓度进行同时测定，适用于大鼠体内MTX和TEF药物代谢动力学的研究以及其它方面的代谢及药动学研究。

本研究得出 MTX的主要药动参数为Cmax为（3627.46 ± 472.16）ng/mL，t1/2z为（2.54 ± 0.23）h，AUC为（6233.42 ± 703.70）ng·h/mL，MRT 为（2.26 ± 0. 35）h，CLz为（0.18 ± 0.02）h。TEF的主要药动参数为Cmax为（12036.42 ± 1736.53）ng/mL，t1/2z为（18. 43 ± 1.67）h，AUC为（156397.33 ± 9913.84）ng·h/mL，MRT 为（16.56 ± 1.49）h，CLz为（0.035 ± 0.002）h。

图2 MTX和TEF在大鼠体内的药时曲线Fig.2 The mean concentration-time curves of MTX and TEF in rats （mean ± SD， n=6）

［1］ 钟南山，陆再英.内科学［M］.第7版.北京：人民卫生出版社，2009：848-851.

［2］ Mclnnes I B， Schett G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis ［J］. N Engl J Med， 2011， 365 （23）: 2205-2219.

［3］ 杨德才，郑新春，王光辉，等.来氟米特和甲氨蝶呤联合用药治疗类风湿关节炎的疗效［J］.中国新药与临床杂志，2004，1（23）：24-26.

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［5］ 姚瑶，丁从珠，葛卫红.高效液相色谱法测定甲氨蝶呤对来氟米特在大鼠体内药动学的影响［J］.中国医院药学杂志，2012，32（23）：1929-1931.

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Pharmacokinetic Research of Methotrexate and Teriflunomide in Rats by HPLC

YANG Guo-tao1，2， LAN Yan1，2
（1. Department of Pharmacy， Huangshi Central Hospital， Affiliated Hospital of Hubei Polytechnic University， Hubei Huangshi 435000， China； 2. Hubei Key Laboratory of Kidney Disease Pathogenesis and Intervention， Hubei Huangshi 435000， China）

A HPLC method was established for determination of plasma concentration of methotrexate and teriflunomide and study on the pharmacokinetics of methotrexate and teriflunomide in rats. The chromatographic conditions were as follows： a Aglient ZORBAX SB-C18 chromatographic column （250 mm × 4.6 mm， 5 µm） was used at 30 ℃. The mobile phase consisted of 50 mM sodium acetate solution-acetonitrile （85：15， v/v） and was pumped at a flow rate of 1.5 mL·min-1. The determination wavelength was 300 nm. Rats were received a single dose of drugs by intravenous injection. The pharmacokinetic parameters of methotrexate and teriflunomide were calculated with DAS 2.0 software. The HPLC method for determining methotrexate and teriflunomide concentration in rat plasma is accurate， rapid， simple， sensitive and repeatability and can be applied to pharmacokinetic studies of methotrexate and teriflunomide.

HPLC； Methotrexate； Teriflunomide； Rats； Pharmacokinetics

TQ 460

A

1671-0460（2015）12-2916-03

2015-08-06

杨国韬（1977-），男，湖北黄石人，主管药师，1995年毕业于黄石卫校药剂专业，研究方向：从事临床药学工作。

兰艳（1986-），女，初级药师，研究方向：ICU临床药师。E-mail： yanlan86@hotmail.com。