王从平，贾敏，李文静，朱祖欣，刘群会

（湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院神经内科，湖北恩施445000）

大豆磷脂对多发性脑梗死大鼠恢复期谷氨酸、γ-氨基丁酸含量及NMDA受体表达的影响

王从平，贾敏，李文静，朱祖欣，刘群会

（湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院神经内科，湖北恩施445000）

目的研究大豆磷脂对多发性脑梗死大鼠恢复期脑组织中谷氨酸（Glu）与γ-氨基丁酸（GABA）的含量及N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体各亚型表达的影响。方法对大鼠颈内动脉给予注射微球血管栓塞剂，建立大鼠多发性脑梗死模型，于脑梗死10 d后给予不同剂量的大豆磷脂，连续干预60 d。采用电子透射显微镜观察并记录脑组织的超微病理结构变化，采用高效液相色谱法分析脑组织中Glu和GABA的含量，采用免疫组化法分析脑组织中NMDA的受体各亚型，包括NR1，NR2A及NR2B的表达变化情况。结果与假手术组大鼠相比，模型组大鼠的恢复期脑组织的神经胶质细胞、神经元及突触的超微结构均有变化，神经递质Glu与GABA的表达均明显减少，而NMDA的受体各亚型NR1，NR2A及NR2B的表达则明显增加。结论大豆磷脂能改善大鼠多发性脑梗死恢复期脑组织的超微结构，并促进神经递质Glu与GABA的合成分泌，抑制NMDA的受体各亚型NR1，NR2A和NR2B的表达，在一定程度上起到保护神经的作用。

大豆磷脂；多发性脑梗死；恢复期；N-甲基-D-天门冬氨酸受体

脑缺血的发病机制涉及到自由基攻击、钙离子超载、继发性炎性反应及兴奋性神经毒反应等联合作用，病理学较复杂，主要表现为神经细胞受损或脑部功能性障碍［1］。大鼠发生脑缺血约30 d后会出现脑组织受损的连续病理学变化，提示脑组织发生缺血后需及时采取积极有效的治疗方案以减轻缺血性损伤［2］。N-甲基-D-天门冬氨酸受体（NMDAR）在脑组织处于缺血缺氧状态时产生兴奋性神经毒性效应，进一步引发脑缺血受损，由于该神经毒性受谷氨酸（Glu）与γ-氨基丁酸（GABA）所诱导，故对其进行干预可保护缺血半暗带的脑组织，加速脑功能的恢复［3］。脑梗死时，脑内的磷脂酶将被激活，其可分解磷脂使其含量下降，大豆磷脂可补充脑梗死大鼠脑内下降的磷脂，抑制脑部局灶性脑梗死大鼠脑中的Glu与GABA的分泌释放，从而达到保护脑组织的作用［4］，但对于处于多发性脑梗死的恢复期，其是否还具有同样的调节作用，需作进一步探讨。本研究中建立了多发性脑梗死大鼠模型，分析了大豆磷脂对脑组织中Glu和GABA的释放及NMDA受体的表达影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

试药：大豆磷脂（黑龙江三江油脂厂，质量标准按1995年版《美国药典》中卵磷脂的质量标准）。盐酸美金刚片（丹麦灵北药厂，国药准字H20120268）；海藻酸钠微球血管栓塞剂（KMG，北京圣医耀科技公司，批号为20093770407）。免疫组化用一抗为NMDAR1（型号NBP1-20085）、NMDAR2A（型号NBP1-21459）、NMDAR2B（型号R-1001-100），均为兔抗大鼠的多抗，由美国NovusBiologicals公司生产；枸橼酸盐缓冲液、磷酸盐（PBS）缓冲液、二氨基联苯胺（DAB）及二抗（型号PV-6000）均为北京中杉金桥公司产品；水合氯醛（国药集团化学试剂公司）。

主要仪器：电化学高效液相色谱仪及工作站（包括16通道Coularray阵列、542自动进样器、582泵、5600A电化学检测器及6210碳石墨电极）；可控温元件（型号CTO-324，美国ESA公司）；低温冷冻离心机（型号IECCL31R，美国Therm公司）；电子透射显微镜（型号H7500，日本日立公司）；显微镜（型号Nikon 55I）；水系（0.22μm）微孔滤膜（天津腾达过滤器厂）；分析天平（型号AG2245）与pH计（型号TELTA 320，上海Mettler Toledo公司）；切片机（型号LEICARM2235）。

动物：60只雄性SD大鼠，体重为235～260 g，由北京维通利华有限公司［动物合格证编号为SCXK（京）2002-0011］培育提供。

1.2 动物造模与分组

所有动物在适应性条件下饲养3 d后开始造模。采用3.5%水合氯醛溶液（给药剂量为0.4 g/kg）给予大鼠腹腔麻醉，颈部去毛并消毒，并于正中作一切口，将颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉分离并将颈外动脉远心端进行结扎，使用动脉夹将颈总动脉夹闭［5］，颈外动脉插管并用注射器由外动脉向内动脉注射0.1mLKMG，使栓子可由内动脉进入颅内到达大脑的各个动脉，形成多发性脑梗死［6］。对于假手术组的大鼠，由外动脉向内动脉注射0.1mL的0.9%氯化钠注射液，将动脉夹松开，并将颈外动脉的近心端结扎，最后将伤口缝合，回笼进行常规饲养。采用青霉素给予抗感染，次日观察各组大鼠的行为表现，如大鼠前肢发生行为学的则判为建模成功［7］。大鼠造模成功后，按给药类型不同随机均分为假手术组（A组）、模型组（B组）、盐酸美金刚组（C组）及大豆磷脂高剂量和低剂量组（D1组和D2组），各12只。于术后第10天开始分别采用灌胃给药的方式给予其蒸馏水、盐酸美金刚（给药剂量为20mg/kg）、大豆磷脂（给药剂量为D2组16.5mg/kg和D1组33.0mg/kg）。每日1次，连续给药60 d。

1.3 指标检测

Glu与GABA含量测定：采用高效液相色谱-电子化学检测（HPLC-ECD）法测定大鼠大脑皮层及海马Glu与GABA的含量［8］。对大鼠快速断头并取脑，将其前皮层及海马进行分离，采用液氮进行固化处理，-70℃冰箱保存。然后于每0.1 g的脑组织中加入1mL的低温工作液，冰浴条件下采用匀浆器匀浆，15 s后在4℃条件下14 000 r/min离心，20 min后取上清液，用0.22μm的滤膜对上清液过滤分装，于-20℃冰箱保存。HPLC测定条件为MSC18色谱柱（50mm×3.0mm，2.5μm），流动相磷酸氢二钠100mmol/L、20%甲醇、3.5%丙烯腈，pH为（6.70±0.03），流速为0.4mL/min，电势为+150mV及+650mV，柱温为30℃，进样量为20μL。

NMDA受体各亚型表达量分析：采用免疫组化法分析［9］。于右侧大脑的囟门和囟门后2mm处冠状切开大脑，取出中间脑组织并固定、包埋、切片及脱蜡至水洗。抗原修复，采用3%的过氧化氢处理，15min后水洗，经PBS洗涤3次后加入一抗（稀释比例为1∶100），4℃过夜孵育，将切片取出放于室温30 min，经PBS洗涤3次后加入二抗，室温孵育30min后经PBS洗涤3次，采用DAB显色，于镜下控制反应时间。经水洗、苏木素复染、脱水及封片后镜下观察。采用IPP 6.0图像分析系统对图像进行分析，测定阳性细胞的平均灰度值。

脑组织常规病理学观察：采用免疫组化法制备石蜡切片（厚度均为4μm），经HE染色后采用乙醇梯度脱水，二甲苯使之透明并用树胶封片。于光镜下对脑组织的神经元坏死、变性、炎性反应及小胶质细胞的增生情况进行观察并记录。

脑组织病理形态观察：大鼠处死后，快速将其脑部取出，前皮层切成约1mm3的块状并浸入4%的戊二醛磷酸缓冲液（pH为7.2）内固定。进行PBS冲洗、乙醇梯度脱水、包埋及切片等过程［10］。将厚度为50 nm的切片经醋酸铀及柠檬酸铅双重染色，采用电子透射显微镜观察神经元、神经突触及胶质细胞的结构变化。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 对Glu和GABA含量的影响

结果见表1。与A组大鼠相比，B组大鼠脑皮层的Glu和GABA含量、海马的Glu含量均明显下降（P＜0.05）；给药60 d后，与B组大鼠相比，C组脑皮层及海马中的Glu和脑皮层的GABA含量均明显升高（P＜0.05），D1组及D2组脑皮层及海马的Glu、D2组脑皮层中的GABA含量均明显升高（P＜0.05）。

表1 大豆磷脂对大鼠脑组织中Glu和GABA的含量影响（±s，n=12）

表1 大豆磷脂对大鼠脑组织中Glu和GABA的含量影响（±s，n=12）

组别A组B组C组D1组D2组脑组织（μg/g）海马（μg/g）Glu 124.90±56.60 74.10±14.00 154.60±108.30 145.20±49.70 148.30±52.10 GABA 19.90±10.00 12.40±5.20 23.80±17.40 11.20±7.00 17.50±4.80 Glu 110.40±52.80 60.40±23.90 137.50±46.70 104.90±35.30 145.90±56.00 GABA 25.20±17.20 17.90±7.10 19.20±10.70 18.00±12.40 21.20±13.20

2.2 对NMDA受体各亚型表达的影响

NMDA各受体亚型包括NR1，NR2A及NR2B在大鼠的前皮层神经细胞胞膜与胞浆发生着色。与A组大鼠相比，B组大鼠脑组织的NMDA各受体亚型高水平表达，其积分灰度值（IOD）差异有统计学意义（P＜0.05）；与B组大鼠相比，C组脑组织的NMDA各受体亚型的表达量均明显下降（P＜0.05）；同时D1组的脑组织中各受体亚型的表达量明显下降（P＜0.05），而D2组则仅有NR1和NR2B 2个受体亚型的表达量明显下降（P＜0.05）。详见图1。

2.3 脑组织病理学变化

经脑组织病理学分析，A组术侧神经元未见变性、坏死或软化灶，也未发生小胶质细胞的增生；B组大鼠神经元发生变性、坏死或软化灶，伴有小胶质细胞发生重度增生；D1组和C组的神经元有变性、坏死或炎性细胞反应，小胶质细胞发生轻度增生，但软化灶不明显；D2组大鼠神经元发生变性、坏死或软化灶，间质炎细胞反应较轻度，小胶质细胞发生中度增生。

2.4 对神经元、胶质细胞和神经突触形态学的影响

通过显微镜观察，A组大鼠的神经元形态较完整，细胞器丰富，可观察到大量的粗面内质网、核糖体及线粒体，且线粒体的嵴较完整；B组大鼠的神经细胞出现了严重的水肿现象，细胞器的数量也明显下降，线粒体的嵴绝大部分出现了融合或模糊不清的现象，空泡化较明显，粗面内质网发生了明显的脱颗粒现象；D1组的神经元细胞的线粒体部分嵴发生少量融合或模糊不清，少数嵴发生断裂或缺失，粗面内质网有轻度的脱颗粒现象，游离核糖体也有减少。

从形态学看来，A组大鼠的神经胶质细胞的细胞器和细胞核大小及形状均正常，线粒体的嵴较完整；B组大鼠的神经胶质细胞线粒体的大部分嵴已模糊不清，部分发生缺失、空泡甚至断裂，粗面内质网中也有颗粒融合或者脱颗粒的现象；D1组的神经胶质细胞，其胞内线粒体的部分嵴模糊不清，有的已缺失或断裂，粗面内质网出现了轻度的脱颗粒。

A组大鼠的突触表现正常；B组的突触间隙表现为模糊不清，突触小泡减小，突触前呈明显的水肿，线粒体表现异常；D1组的突触前线粒体呈明显的空化，部分膜发生融合，模糊不清，且突触小泡减少，但间隙较清楚。

3 讨论

发生脑梗死时，脑中的磷脂酶会被激活，可将磷脂分解为游离的脂肪酸，使细胞膜受损，细胞内、外的物质交换及能量代谢将受到影响。维持细胞膜的完整性及其正常的生理功能需使脑内的磷脂含量维持在一个合适的水平［11］。抑制脑梗死患者脑内磷脂含量降低的措施较多，传统方法常采用磷脂酶A2的抑制剂，如磷脂酶C抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF），但其特异性较差，不良反应较大。胞二磷胆碱在体内可生成胆碱而促进脑中磷脂酰胆碱的合成，从而减少脑中的磷脂含量。在治疗脑梗死时，大豆磷脂对患者的神经功能缺损具有显著的改善作用，临床疗效较明显［12］。

Glu作为动物中枢神经系统的主要神经递质，可有效激活脊髓神经元和海马神经元的电生理活动，通过激活相应受体而对神经元的分化、神经系统的发育及神经元与胶质细胞的偶联均有重要的作用［13-14］。本研究中，通过观察神经系统的超微结构和脑部组织中Glu与GABA的含量变化，可看出在多发性脑梗死恢复期的过程中，脑缺血缺氧引发的神经元中线粒体的呼吸功能减退而使中枢神经系统发功能性障碍，进而引起脑部功能性障碍。

NMDA受体作为兴奋性氨基酸受体，在静息状态下，Mg2+结合于通道上以阻止Ca2+内流［15］。当脑组织发生缺血缺氧时，会引发细胞膜的去极化，Mg2+对NMDA受体的阻滞作用被削弱，NMDA受体被活化，Ca2+大量内流而使神经元受损，加大了Glu的兴奋性毒性，可通过阻断NMDA受体来干预谷氨酸的兴奋性毒性作用，避免对神经元的损伤［16］。本研究结果表明，模型组的脑部神经元的NMDA各受体亚型NR1，NR2A及NR2B的表达均较高。可见在多发性脑梗死恢复期时NMDA受体的高表达可破坏神经元。因此，通过控制神经递质Glu和GABA的表达水平及NMDA的受体表达，可减缓脑梗死恢复期的神经元受损，促进脑功能的恢复。

本研究中采用大豆磷脂治疗多发性脑梗死恢复期的大鼠，结果表明，其可使脑组织中Glu与GABA的含量升高，还可下调NMDA受体的表达，证实大豆磷脂可促进中枢神经功能的恢复，还可减缓神经元受损。其作用机制可能为：大豆磷脂主要成分是磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇和磷脂酰乙醇胺，这些组分可被磷脂酶分解；发生脑梗死时，梗死的部位能量被大量耗竭，由胆碱合成磷脂酰胆碱的代谢受阻，且随缺血程度的加重，代谢更加困难，而大豆磷脂中各磷脂成分属于完整的磷脂，无需耗能即可合成，其进入机体即被磷脂酶分解，然后可添补细胞膜缺损，使缺血部位的磷脂含量不至减少过多，保持了细胞膜的完整性，大大减缓了磷脂酶对神经元的损伤。

［1］孟冬娅，胡晓芳，郭大文，等.大豆磷脂对脑梗死患者血脂的治疗作用研究［J］.辽宁中医杂志，2002，29（6）：342-343.

［2］Kruse MS，Prémont J，Krebs MO，et al.Interaction of dopamine D1 with NMDA NR1 receptors in rat prefrontal cortex［J］.European Neuropsychopharmacology，2009，19（4）：296-304.

［3］张新，肖建英，刘宇杰，等.大豆磷脂脂质体对谷氨酸所致体外神经细胞损伤的保护作用［J］.中国临床康复，2006，10（3）：42-44.

［4］凌雅萍.血塞通加康复训练治疗缺血性脑卒中85例［J］.中国药业，2013，22（6）：104-105.

［5］Finlay JM，Dunham GA，Isherwood AM，et al.Effects of prefrontal cortex and hippocampal NMDA-NR1 subunit deletion on complex cognitive and socialbehaviors［J］.Brain Research，2015（1 600）：70-83.

［6］Kojima M，Kuno Y，Nakagami H，et al.Pharmaceutical composition：U.S.Patent Application 13/968，776［P］.2013-08-16.

［7］李淑芳.颞叶癫痫中医证候研究及柴贝止痫汤对癫痫大鼠GABA_AR、NMDAR1表达的影响［D］.北京：北京中医药大学，2009.

［8］Weise G，Basse-Lüsebrink TC，Kleinschnitz C，et al.In vivo imaging of stepwise vessel occlusion in cerebral photothrombosis of mice by 19F MRI［J］.PloSOne，2011，6（12）：e28 143.

［9］张敏.脑缺血再灌注大鼠学习记忆与海马NMDA受体亚单位表达关系的探讨及人参皂苷Rg2的干预［D］.青岛：青岛大学，2006.

［10］石富成，周景春，孟冬娅，等.大豆磷脂对脑梗死治疗作用的研究［J］.中华医学杂志，2001，81（21）：1 301-1 303.

［11］朱小姗.电针对大鼠脑卒中痉挛状态Glu、GABA受体亚型表达的影响［D］.长沙：湖南中医药大学，2012.

［12］Xi D，Li YC，Snyder MA，et al.Group IImetabotropic glutamate receptor agonistameliorates MK801-induced dysfunction of NMDA receptors via the Akt/GSK-3βpathway in adult rat prefrontal cortex［J］.Neuropsychopharmacology，2011，36（6）：1 260-1 274.

［13］李良.电针对脑卒中痉挛性瘫痪血清Glu、GABA含量影响的研究［D］.长沙：湖南中医药大学，2011.

［14］Gilmartin MR，Kwapis JL，Helmstetter FJ.NR2A-and NR2B-containing NMDA receptors in the prelimbicmedial prefrontal cortex differentially mediate trace，delay，and contextual fear conditioning［J］.Learning& Memory，2013，20（6）：290-294.

［15］鄢泽然.柴贝止痫汤影响难治性癫痫耐药蛋白表达及海马GLU、 γ-GABA含量的研究［D］.北京：北京中医药大学，2014.

［16］MoréMI，Freitas U，Rutenberg D.Positive Effects of Soy Lecithin-Derived Phosphatidylserine plus Phosphatidic Acid on Memory，Cognition，Daily Functioning，and Mood in Elderly Patients with Alzheimer′s Disease and Dementia［J］.Advances in Therapy，2014，31（12）：1 247-1 262.

Effect of Soybean Lecithin on Content of G lu，GABA and Expression of NMDA Receptor Subtypes in Recovery Period of Multiple Cerebral Infarction Rats

Wang Congping，Jia Min，Li Wenjing，Zhu Zuxin，Liu Qunhui
（Department of Neurology，The Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture，Enshi，Hubei，China 445000）

Objective To analyze the effects of soybean lecithin on levels of Glu，GABA and the expression of NMDA receptor subtypes in recovery period of multiple cerebral infarction rats.Methods To establish multi-infarct model rats by injecting embolizing micro-sphere via internal carotid artery，10 d after cerebral infarction，different content of soybean lecithin were given for the treatment for 60 d. The pathological changes of brain ultrastructure were observed and recorded by electron transmission microscope.The expression levels of Glu and GABA of brain tissue were measured and analyzed with HPLC.And the expression of NMDA receptors of each subtypes including NR1，NR2A and NR2B in neurons was measured by immune histochemical staining.Results Compared with the rats of sham there were some abnormal changes in the ultra structures of neurons and neuroglia cells and synapses of the model rat，the levels of Glu and GABA decreased significantly，but the expression of NR1，NR2A and NR2B increased significantly.Conclusion Soybean lecithin can improve the ultra structure of cerebral tissue，facilitate synthesis the levels of Glu and GABA，and induce the expression of subtypes of NR1，NR2A and NR2B in neurons，and it has neuroprotective effect.

Soybean lecithin；multiple cerebral infarction；recovery period；NMDA receptor

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2015）22-0085-04

王从平（1974-），男，土家族人，大学本科，副主任医师，研究方向为脑血管疾病的诊治，（电子信箱）wcp0413@ 163.com。

2015-06-17）