王婧，张沂

（中国人民解放军海军总医院，北京100048）

奥沙利铂联合热疗对胃癌耐药细胞基因表达及增殖的影响

王婧，张沂

（中国人民解放军海军总医院，北京100048）

目的观察奥沙利铂联合热疗对胃癌耐药细胞基因GST-π，survivin和P-gp表达及增殖的影响。方法体外培养人胃癌SGC7901/DDP细胞，取其生长对数时期待用。设置对照组、化学治疗（简称化疗）组、热疗组和热化疗组，并应用流式细胞术（FCM）检测每组中人胃癌细胞的增殖情况；采用FCM方法半定量检测各细胞中GST-π，survivin和P-gp基因蛋白表达变化。将热化疗组置于37～43℃不同的恒温箱中进行试验，72 h后使用酶标仪检测不同温度的吸光度。结果热化疗可抑制GST-π，survivin和P-gp基因的表达，且抑制效果与外界温度呈正相关；热疗和奥沙利铂联合热疗对人胃癌细胞SGC7901/DDP的增殖均有明显的抑制作用；奥沙利铂联合热疗下降效果最明显。结论热疗及奥沙利铂联合热疗均能抑制体外培养的人胃癌SGC7901/DDP细胞的增殖和表达，并能抑制该细胞的凋亡。肿瘤基因的表达与热疗温度在37～43℃内呈正相关。

热疗；奥沙利铂；胃癌；耐药细胞

随着多药耐药（MDR）现象的出现，影响了化学治疗（简称化疗）对恶性肿瘤的疗效。热疗又称熏蒸，是治疗癌症患者的一种新方法。有研究发现，热疗和化疗能协同作用于癌症患者，且比单一化疗效果更好，患者无瘤期更长［1］。本研究中通过对比奥沙利铂联合热疗对人胃癌耐药细胞株的作用，并分析细胞增殖对GST-π，survivin和P-gp基因表达的影响，探索解决胃癌化疗耐药的新途径，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃腺癌耐药细胞株SGC7901/DDP（南京凯基生物有限公司），置RPMI1640培养液中，加入质量浓度为1μg/mL的奥沙利铂（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号为8956542DC）用来维持耐药性。兔抗人GST-π多克隆抗体、兔抗人survivin多克隆抗体和兔抗人P-糖蛋白（上海蓝基生物科技有限公司）。

1.2 方法

分组：选择培养液中生长对数期的细胞，通过常规胰蛋白酶消化后，以5.0×105/瓶接种于25 mL培养瓶中，培养24 h至细胞贴壁后，用含奥沙利铂0.1μg/mL的RPMI1640培养基换液。注意先将热疗组和热化疗组在43℃恒温水浴箱中加热2 h后，再与对照组、化疗组一起在37℃、5%的二氧化碳培养箱中继续培养24 h。

流式细胞术（FCM）法检测细胞周期分布和细胞凋亡：选取人胃癌耐药株细胞对数生长期，应用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，然后用生理盐水洗涤2次，除去上清液，加油溴化丙啶1mL染色，立刻冰浴30min，用铜网过滤得到单细胞悬液，用流式细胞仪对细胞的DNA进行定量分析，计算出细胞周期的时相分布和凋亡率，按相应的公式计算增殖指数（PI）［2］。

FCM法半定量检测细胞的耐药基因蛋白表达：选取对数生长期细胞，各组均重复3瓶取平均值。常规胰蛋白酶对细胞进行消化，用PBS液离心洗涤2次，用70%冷乙醇（4℃）固定。调整细胞浓度为1.0×106/mL，选取配好的单细胞悬液1mL，分别加入兔抗人GST-π多克隆抗体、兔抗人survivin多克隆抗体和兔抗人P-糖蛋白0.1mL（工作浓度1∶50），在室温下孵育30min，再用PBS液洗3次；分别加入100μL羊抗兔IgG二抗工作液，室温下避光孵育30 min，最后用PBS液洗3次后上机检测。上机设定PBS为阴性对照，只加二抗作为本底对照［3］。以荧光指数（FI）作为表达蛋白的指数。平均荧光强度（均道值）=lg（测量值）×340。FI=实际样品均道值/对照样品均道值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 细胞增殖的比较

与对照组相比，化疗组各细胞周期无明显变化（P＞0.05）；热疗组和热化疗组在G0/G1期的细胞比例逐渐升高，而S期的细胞比例明显降低（P＜0.05）；热疗组G2/M的细胞比例比对照组和化疗组有所增加，但差异不具有显著性（P＞0.05）；热化疗组相比其他各组各时期的细胞都有非常显著的变化（P＜0.05）；化疗组和热化疗组的PI相对对照组有所降低，但无明显差异；热化疗组的PI明显低于其他各组（P＜0.05）。详见表1。

2.2 细胞耐药基因的表达

结果见表2。

2.3 热化疗与孵育温度的关系

由表3可见，在对人胃癌细胞SGC7901/DDP热化疗72 h后，不同的热疗温度下，人胃癌细胞株表达的GST-π，survivin和P-gp的量也各不相同，由整体趋势可见，随着热疗温度的升高，耐药基因表达的量在不断减少，且不同温度组间的表达差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 4组细胞周期及PI变化比较（±s，%，n=3）

表1 4组细胞周期及PI变化比较（±s，%，n=3）

注：与对照组相比，①P＜0.05；与化疗组相比，②P＜0.05；与热疗组相比，③P＜0.05。

组别对照组化疗组热疗组热化疗组G0/G143.77±2.14 43.66±2.21 48.31±0.28①②61.09±1.59①②③S 40.17±0.81 40.31±0.69 34.49±1.48①②16.71±0.86①②③G2/M 15.78±2.54 15.93±3.01 17.29±1.75 22.13±2.29①②③PI 84.12±2.54 84.07±3.01 82.68±1.78 77.80±2.31①②③

表2 4组细胞FI值比较（±s）

表2 4组细胞FI值比较（±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别对照组化疗组热疗组热化疗组GST-π 1.000±0.000 1.012±0.021 0.749±0.020*0.398±0.059*survivin 1.000±0.000 1.013±0.019 0.721±0.013*0.648±0.019*P-gp 1.000±0.000 1.009±0.021 0.704±0.011*0.451±0.020*

表3 奥沙利铂联合热疗对人胃癌细胞作用72 h后耐药基因表达的影响（±s）

表3 奥沙利铂联合热疗对人胃癌细胞作用72 h后耐药基因表达的影响（±s）

温度37℃38℃39℃40℃41℃42℃43℃P GST-π 22.21±4.72 20.56±3.94 18.79±5.21 17.16±5.17 14.84±5.13 12.94±5.24 11.54±5.11＜0.05 survivan 5.78±1.31 4.35±0.88 3.33±0.78 2.34±1.01 1.09±0.95 0.67±0.12 0.13±0.03＜0.05 P-gp 18.54±3.61 16.86±2.68 15.57±2.16 13.98±3.49 11.61±2.67 9.62±2.10 7.68±3.11＜0.05

3 讨论

化疗是手术外治疗胃癌患者最重要的方法，随着研究的深入，不同机制的MDR成为了肿瘤化疗的一大难题［4］。热疗的作用机制是热诱导细胞凋亡来杀伤肿瘤细胞，大量临床观察证实，热疗选择性杀死肿瘤细胞在临床治疗时有重要价值［5］。在此基础上，本研究中分析了热疗和热化疗对癌症患者的不同效果。热疗的作用机制：肿瘤内部血流速度慢、血流量低，在进行加热后，肿瘤组织的温度明显升高，同时正常组织变化不明显，可在不损伤正常组织细胞的前提下抑制肿瘤细胞；高热量使肿瘤组织热量聚集、pH降低、缺乏能量，直接损伤肿瘤细胞；高温同时不适合肿瘤细胞中DNA，RNA及蛋白的合成；高温可改变细胞结构，不可逆地破坏肿瘤细胞的细胞器；温度影响肿瘤细胞的生物膜，改变膜通透性；高温提高机体免疫系统活性［6］。本研究结果显示，热化疗比热疗效果更佳，作用机制为高温加速肿瘤组织附近血液循环，渗透性升高使得化疗药物更容易进入细胞［7］；生物膜通透性随着温度升高而改变；高温破坏了DNA分子结构，减少癌细胞产生变异后代。

本研究结果显示，热疗和热化疗均会造成G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，同时热化疗作用效果最明显。温度在37～43℃时人胃癌细胞SGC7901/DDP的生长抑制作用随温度的升高而逐渐加强。与相关试验的结论热疗可导致肿瘤细胞中MDR1，MDP1，GST-π的耐药基因表达量大幅度减少［8-9］相符。

综上所述，奥沙利铂联合热疗能抑制体外培养的人胃癌SGC7901/DDP细胞的增殖和表达，并能抑制该细胞的凋亡，为临床热疗逆转胃癌耐药提供了试验依据。同时发现，肿瘤的表达基因与热疗温度在一定范围内呈正相关。但肿瘤耐药机制非常复杂，有很多的耐药机制，需更多的试验研究［10］。

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R969.4；R979.1

A

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王婧（1982-），女，大学本科，主管药师，研究方向为医院药学，（电话）010-66957612。

2015-02-05；

2015-05-08）