郑钧予 丑建栋 彭晓龙 何媛媛 席丽琴 张柏林

摘要

[目的]优化黑木耳多糖酶法提取的工艺条件。[方法]采用复合酶法提取木耳多糖，以多糖的提取率为指标，考察了酶解温度、酶解溶液pH、浸提料液比以及酶解时间对黑木耳多糖提取效率的影响，并采用TLC薄层色谱层析法分析提取出的黑木耳多糖的成分。[结果]试验确定了复合酶酶解提取黑木耳多糖的最佳工艺条件：浸提料液比1∶40 g/ml ，酶解溶液pH 7.0，酶解温度40 ℃，酶解时间3.0 h。在此条件下，黑木耳多糖的提取率为4.353%，所含有的单糖为D葡萄糖。[结论]研究可为黑木耳多糖的提取提供参考依据。

关键词 黑木耳;多糖;复合酶解;薄层层析

中图分类号 S646.6  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2015）03-183-03

Study on Compound Enzymatic Hydrolysis of Jewsears Polysaccharides

ZHENG Junyu， CHOU Jiandong， PENG Xiaolong， ZHANG Bolin*

（College of Biological Sciences and Technology， Beijing Forestry University， Beijing 100083）

Abstract [Objective] To optimize compound enzymatic hydrolysis of Jewsears polysaccharides. [Method] With polysaccharides yield as indicator， effects of enzymatic temperature， solution pH， solidliquid ratio，enzymatic time on yield of Jewsears polysaccharides were investigated. TLC method was used to analyzed the compounds of Jewsears polysaccharides. [Result] The experiments determine the optimum conditions for enzymatic hydrolysis of Jewsears polysaccharides： leaching agent multiples is 1 to 40， pH is 7.0， temperature is 40 ℃， time is 3.0 h. Under this condition， Jewsears polysaccharides extraction rate is 4.353%. The monosaccharide composition of polysaccharides is Dglucose. [Conclusion] The study can provide reference basis for extraction of Jewsears polysaccharides.

Key words  Jewsear; Polysaccharides; Compound enzymatic; TLC

作者簡介

郑钧予（1993-） ，男，广西桂林人，本科生，专业：食品科学与工程。*通讯作者，教授，博士生导师，从事食品微生物、食品安全方向的研究。

收稿日期 20141209

黑木耳又称云耳、黑菜，是一种质优的胶质食用菌和药用菌。我国黑木耳资源丰富，年产量5 000 t左右，占世界总产量的 90%以上，为开发应用黑木耳提供了有利条件。黑木耳多糖具有调节免疫、抗衰老、抗癌防癌等作用^[1-3]。黑木耳中含有丰富的甘露聚糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、葡萄糖醛酸等碳水化合物^[4]，对人体有极大的益处。

提取多糖常用的方法有^[5-8]：热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法、酶法、超声波法、微波法等。林敏等探索出热水浸提法提取黑木耳多糖的最佳工艺条件：黑木耳子实体干粉与水之比为1∶50，在90 ℃水浴中抽提3.5 h，提取液用70%乙醇醇析，在此工艺条件下多糖得率最高^[9]。使用此法所需浸提剂蒸馏水经济易取，但需多次浸提，相对于其他提取方法多糖得率依然很低，且费时费工，效率低下。包海花等研究使用蒸馏水和1 mol/L NaOH溶液对黑木耳多糖得率的影响时发现，在其他条件相同的情况下，采用稀碱液浸提后不但能节省时间而且能减少原材料及试剂的消耗，提取的糖含量高，但是使用该种方法容易使多糖发生水解，破坏多糖的活性结构，且提取后液体需要中和，程序繁琐^[10]。韩秋菊通过比较热水浸提法、微波辅助浸提法、超声波辅助浸提法得出结论，超声波辅助提取法效率最高，优于另两种方法，但设备要求较高，提取所需温度较高、能耗较大^[11]。姜红等分别从浸提剂倍数、pH、酶解温度、酶解时间、酶加量5个方面对多糖得率进行分析，并在这5方面对比果胶酶与纤维素酶作用，发现在2种酶反应体系中，最适工艺参数较为接近，为黑木耳双酶水解提供了依据^[12]。因此，笔者采用复合酶法提取木耳多糖，并探究其最佳工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

原料及主要试剂。黑木耳，绥芬河市维多宝食品有限公司;果胶酶，上海源叶生物科技有限公司，活性1 000 U/mg;木瓜蛋白酶，北京奥博星生物技术有限责任公司，活性500 000 U/g;绿色木酶，活性11 000 U/mg上海源叶生物科技有限公司;蒽酮，北京化工厂，化学纯; 硫酸、乙醇、正丁醇、三氯甲烷等化学试剂均为分析纯，北京化工厂。

1.1.2

主要仪器设备。GL20GII型飞鸽牌离心机;FD1冷冻干燥机，北京德天佑科技发展有限公司;DSY28电热恒温水浴锅，北京国华医疗器械厂;W201B恒温水浴锅，上海申顺生物科技有限公司;SHZIII真空抽滤机，上海知信实验仪器技术有限公司;722E型可见型分光光度计，上海光谱仪器有限公司;JA2003上皿电子天平，上海精科天平;LD42低速离心机，北京医用离心机厂。

1.2 试验方法

1.2.1

原材料预处理。   剔除发霉、变质等不合格木耳及杂质，将干木耳粉碎，过40目筛，制成干木耳粉，置于干燥阴凉处备用。

1.2.2

复合酶法提取工艺以及工艺流程。    按照参照文献^[13]的方法（有改动）：称取一定量经过预处理的木耳，溶于一定体积的pH缓冲溶液中，在不同条件下保温酶解，然后迅速升温至90 ℃灭酶、热水浸提2 h，将混合物离心、浓缩、乙醇沉淀，静置过夜（10 h以上），沉淀离心分离，冷冻干燥后得到粗多糖，待测。在复溶后经sevag法^[14]脱蛋白后冷冻干燥得精多糖。

工艺流程：黑木耳→打粉→黑木耳粉末→加酶热浸提→高温灭酶→抽滤→乙醇沉淀→冷冻干燥→粗多糖→溶解→sevag法除蛋白→浓缩→冷冻干燥→精多糖。

1.2.3

各因素对提取率的影响。

分别将果胶酶和纤维素酶作为水解用酶，以浸提剂倍数、pH、温度、时间为可变因素，研究各因素对多糖得率的影响规律。在各单因素试验的基础上再进行正交试验优化提取工艺。

1.3  测定方法

采用蒽酮-硫酸法^[15-17]（有改动）测定黑木耳多糖含量。蒽酮试剂：称取 0.2 g蒽酮和1.0 g硫脲（阻氧化剂）置于烧杯中，缓慢加入 100 ml浓硫酸，边加边搅拌，溶解后呈黄色透明溶液。将其置于棕色瓶中，现用现配。葡萄糖标准使用液：取葡萄糖标准品于102 ℃干燥至恒重，准确称取0.1 g葡萄糖溶于1 L蒸馏水中，配成 0.1 mg/ml 的葡萄糖溶液。

1.4 标准曲线的制作

按表1配制系列标准溶液。在冰水浴中加入蒽酮-硫酸溶液4.00 ml，混匀，沸水浴10 min，冷却后用分光光度计测定620 nm波长处的吸光度，绘制标准曲线，建立回归方程。

表1 标准溶液配制

浓度∥mg/ml葡萄糖标准溶液∥μl加水量∥μl合计∥μl

001 0001 000

0.02209801 000

0.04409601 000

0.08809201 000

0.121208801 000

0.161608401 000

1.5 多糖提取液的测定

取干燥好的多糖0.01 g，配制成0.1 g/ml的多糖溶液，取多糖提取液1 000 μl于试管中，加入配制好的4 ml蒽酮-硫酸溶液，混匀，置于冷水浴10 min，沸水浴10 min，流水冷却10 min后用分光光度计测定620 nm波长处的吸光度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

试验得葡萄糖标准曲线如图1所示，回归方程y=0.006 9x-0.015 4。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 温度对木耳多糖提取率的影响

酶解条件为：pH 7，时间3 h，选取浸提料液比为1∶40 g/ml，酶加量（绿色木霉11 000 U+果胶酶8 000 U+纤维素酶10 000 U），提取温度为30、40、50、60 ℃，酶解后升温至90 ℃热水浸提1.5 h，经离心、浓缩、醇沉后测定多糖含量。

在酶催化反应中，温度是重要参数之一。随着温度的升高，反应物的活化能增加，使反应速度加快。而超过其最适温度后，反应速率会显著降低，这是由于温度过高使酶的蛋白质变性导致其活性降低甚至失去活性，反应速率也会随着温度升高而下降。温度过高可能会使酶失去活性，最后提取到的多糖完全是热水浸提法得到多糖，与酶解无关。

如图2所示，40 ℃时复合酶提取的效率最高，达到最大值后继续升温，提取效率反而下降，因此选择最好的提取温度为40 ℃。

图2 温度对提取效率的影响

2.3 pH对多糖得率的影响

酶解条件为：时间3 h，选取浸提料液比为1∶40 g/ml，酶加量绿色木霉11 000 U+果胶酶8 000 U+纤维素酶10 000 U，提取温度为40 ℃，pH为5、6、7、8、9。酶解后升温至90 ℃熱水浸提1.5 h，经离心、浓缩、醇沉后测定多糖含量。

pH影响酶活力，适当的pH，通过静电作用，维持了酶活性中心的最佳三维构象，促进酶与底物结合;pH还会影响酶催化速度，pH不同，酶及作用底物所带电荷不同，酶的立体构象以及酶与底物的亲和力不同，催化速度也就不同。

酶在最适pH范围内表现出活性，大于或小于最适pH，都会降低酶活性。主要表现在2个方面：改变底物分子和酶分子的带电状态，从而影响酶和底物的结合;过高或过低的pH都会影响酶的稳定性，进而使酶遭受不可逆破坏。如图3所示，测得的最适pH为7。在此条件下，酶解的效率最高，得到的多糖量最多。

图3 pH对多糖提取效率的影响

2.4 浸提料液比对多糖得率的影响

酶解条件为：时间3 h，选取浸提料液比为1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55  g/ml，酶加量绿色木霉11 000 U+果胶酶8 000 U+纤维素酶10 000 U，提取温度为40 ℃，pH为7。酶解后升温至90 ℃热水浸提1.5 h，经离心、浓缩、醇沉后测定多糖含量。