罗臻 黄静敏 陈血建 赖心田 兰全学 杨国武

摘要 胶原蛋白（PSC）是海参蛋白的主要组成，研究其理化性质为海参的进一步利用提供理论基础。以格皮氏海参为原料，采用胃蛋白酶促溶法提取海参胶原蛋白，并通过聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳、氨基酸分析以及傅立叶红外光谱对其理化性质进行研究。结果表明，海参胶原蛋白分子组成为（α₁）₃，α₁的分子量约为150 kD;氨基酸组成以甘氨酸含量最高（6.01%），脯氨酸与羟脯氨酸含量为6.14%，符合水产胶原蛋白特征;傅立叶红外光谱分析结果表明其保持三螺旋结构。

关键词 胶原蛋白;海参;提取;理化性质

中图分类号 S986.1;O657.7+1  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2015）03-145-02

Extraction and Physicochemical Properties of Pepsinsolubilized Collagen from Sea Cucumber

LUO Zhen， HUANG Jingmin， CHEN Xuejian， YANG Guowu* et al

（Shenzhen Academy of Metrology and Quality Inspection， Shenzhen， Guangdong 518000）

Abstract Pepsinsolubilized collagen （PSC） is the main component of sea cucumber protein， and the study of its physicochemical properties will provide theoretical basis for taking better advantage of sea cucumber. PSC was extracted by pepsinsolution method from sea cucumber （Pearsonothuria graeffei） and analyzed through SDSPAGE， amino acid composition analysis and FTIR. The results of SDSPAGE suggested the structure of PSC Was（α₁）₃and the molecular weight of α₁chain was about 150 kD. Amino acid composition analysis showed that the content of glycine was high（6.01%）， and the level of proline and hydroxyproline was 6.14%， in accordance with the aquatic collagen characteristics. FTIR spectrogram indicated the existence of triplehelix structure.

Key words Collagen; Sea cucumber; Extraction; Physicochemical property

作者简介 罗臻（1988- ），男，广东清远人，硕士研究生，研究方向：应用微生物。*通讯作者，高级工程师，从事生物化学方面的研究。

收稿日期 20141120

海参属于无脊椎棘皮动物们，具有较高的营养价值与药学价值，是我国重要的食药用保健品^[1]。海参体内含有蛋白质、脂肪、维生素、多种微量元素、胶质、海参、海参皂甙和酸性粘多糖等成分，但不含有胆固醇^[2]。胶原蛋白是海参蛋白的主体，是海参体内含量最为丰富的一种生物活性成分。由多糖蛋白分子组成的独特结构使胶原蛋白具有合成高分子所无可比拟的生物相容性、生物降解性和低抗原性，具有一系列重要的生物学功能^[3]。胶原蛋白的提取方法有很多，其基本原理都是根据胶原蛋白的特性来改变蛋白质所在的外界环境，从其他蛋白质中分离出来，在实际提取过程中不同方法往往相互结合^[4]。笔者以海参为原料，通过酸、酶结合法提取胶原蛋白，使海参資源得以合理开发与利用，从而利于提高其加工的综合效益及经济附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 格皮氏干海参;

胃蛋白酶（Sigama公司）;醋酸、氢氧化钠（分析纯，天津市红岩化学试剂厂）;磷酸氢二钠（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）;氯化钠（分析纯，广州化学试剂厂）;EDTA、TRIS（分析纯，深圳新拓扑生物科技有限公司）;β巯基乙醇（北京鼎国生物技术有限责任公司）;十二烷基硫酸钠（SDS）、过硫酸铵（Biosharp生物科技有限公司）;甘氨酸（美国Amresco公司）;30%丙烯酰胺（美国Biorad公司）。

1.2 试剂配制

配制含0.5 mol/L NaCl、50 mmol/L EDTA、0.2 mol/L β巯基乙醇、0.1 mol/L TrisHCl（pH 8.0）的海参提取液1 000 ml待用。

1.3 仪器

GL加热磁力搅拌器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）;T25高速组织捣碎机（德国IKA公司）;pH计、高速冷冻离心机（Beckman Coulter公司）;U410超低温冷冻贮存箱（B德国Eppendorf公司）;BT 224S电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）;ALPHA 12真空冷冻干燥机（德国Christ公司）;SDSPAGE电泳仪（美国Biorad公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 胶原蛋白的提取^[5]。

将去除内脏的海参原材料粉碎后，称取100 g组织碎片，加入1 000 ml提取液浸泡，置于4 ℃中搅拌72 h，纱布过滤后取滤液离心（7 500 g，30 min），将沉淀物用双蒸水洗至中性，置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥;称取1 g干燥物，加入1 000 ml 0.1 mol/L NaOH浸泡，4 ℃搅拌24 h，离心（7 500 g，30 min）后沉淀水洗至中性，冻干;重悬浮于500 ml 0.5 mol/L乙酸中，按干重比100∶6加入胃蛋白酶充分搅拌，4 ℃下提取48 h后離心（7 500 g，1 h），取上清液加入NaCl至终浓度为0.8 mol/L进行盐析，离心（9 000 g，1 h），沉淀重悬浮于0.5 mol/L乙酸，于0.02 mol/L磷酸氢二钠（pH 8.0）中透析48 h，每隔3 h更换透析液，离心后取沉淀再溶于0.5 mol/L 乙酸，在0.1 mol/L 乙酸中透析48 h，冷冻干燥即得胃蛋白酶促溶胶原蛋白制品（P S C）。

1.4.2 SDSPAGE分析。

采用SDSPAGE垂直电泳，分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%，Tris甘氨酸缓冲系统。电泳缓冲液为Tris甘氨酸缓冲液（pH 8.3，含0.1%SDS），4×样品缓冲液（100 mmol/L TrisHCl 缓冲液、20%甘油、4%SDS、200 mmol/L β巯基乙醇、0.2%溴酚蓝），染色液为0.1%的考马斯亮蓝R250甲醇-冰醋酸（9∶9∶2，V/V/V）;脱色液为水-甲醇-冰醋酸（8∶1∶1，V/V/V）。取PSC 1 mg溶于0.5 mol/L的醋酸溶液中，调节pH为中性，加入样品缓冲液，沸水浴煮沸5 min，5 000 r/min离心5 min取20 μl上样。采用直流恒压电源，电压为100 V，凝胶成像系统分析^[6-7]。

1.4.3 氨基酸分析。

参照GB/T5009.1242003的方法，精确称取10 mgPSC，使用日立83550型氨基酸自动分析仪对其主要氨基酸组成进行分析。

1.4.4 红外光谱分析。

利用胶原蛋白肽键中分子结构与红外吸收带的波长位置与吸收谱带的吸收强度相对应的特点，采用傅立叶变换红外光谱对冻干的胶原蛋白进行投射扫描。参照GB/T60402002的方法，在红外灯照射下将适量样品和KBr混匀研成粉末状。取样品压片，将样品放入样品室。用傅立叶变换红外光谱仪在400～4 000 cm^-1区间扫描，分辨率设置为2 cm^-1。

2 结果与分析

2.1 SDSPAGE电泳分析 从图1可以看出，提取的PSC的电泳图由α、β、γ 3条链组成，与文献报道的结果一致^[8]。α₁链的分子量约为150 kD，未见α₂链，因此PSC分子组成可能为（α₁）₃。β、γ链的分子量在250 kD以上。

注：A.次高分子量标准;B.海参PSC。

图1 海参胶原蛋白的SDSPAGE电泳图谱

2.2 氨基酸分析

由表1可知，PSC所含氨基酸种类齐全，具有典型胶原蛋白的组成。氨基酸总量达PSC的33.07%。其中，必需氨基酸总量达PSC的5.29%，占氨基酸总量的16%;鲜味氨基酸总量达PSC的19.04%;药效氨基酸总量达PSC的17.69%，结果表明海参胶原在医学和营养学上具有一定的营养价值。在氨基酸中Gly含量最高，约占氨基酸总量的1/5;Glu、Ala、Pro和Asp含量较高，而Met、Tyr和Val含量较低，但未检测到Trp和Cys。PSC的亚氨基酸（脯氨酸+羟脯氨酸）含量为6.14%，羟脯氨酸与脯氨酸之比约为0.8，二者符合水产胶原蛋白的特征^[9]。氨基酸的这种组成形式，表明胶原蛋白为海参蛋白的主要组成成分。

Hyp是胶原蛋白的特征氨基酸，一般通过测定其含量可确定胶原蛋白的含量^[10]。从表1可以看出，提取的PSC中Hyp含量较低，这可能是由于海参皮中含有较多即原纤维蛋白和肌浆蛋白，且大部分为碱性蛋白^[4]。由于酶法提取破坏了胶原蛋白的空间结构，提高了胶原蛋白得率的同时也造成了肌原纤维蛋白和肌浆蛋白的溶出，影响了所提取的胶原蛋白的纯度。此外，由于胃蛋白酶和酸溶液的影响，在提取过程中可能造成胶原蛋白分子一定程度上的降解。

表1 PSC的氨基酸组成

氨基酸种类胶原蛋白

含量∥%氨基酸种类胶原蛋白

含量∥%

天冬氨酸Asp²，32.86 苯丙氨酸Phe¹，30.64

苏氨酸Thr¹1.65 赖氨酸Lys¹，30.99

丝氨酸Ser1.17组氨酸His1.28

谷氨酸Glu²，34.51精氨酸Arg²，32.49

甘氨酸Gly²，36.01脯氨酸Pro3.31

丙氨酸Ala²3.17羟脯氨酸Hyp2.83

缬氨酸Val¹0.79必需氨基酸总量5.29

蛋氨酸Met¹，30.04鲜味氨基酸19.04

异亮氨酸Ile¹0.44药效氨基酸总量17.69

亮氨酸Leu¹0.74氨基酸总量33.07

酪氨酸Tyr³0.15

注：1.必需氨基酸;2.鲜味氨基酸;3.药效氨基酸。

2.3 红外光谱分析

从图2可以看出，PSC的酰胺A吸收峰为3 464 cm^-1，酰胺B吸收峰在2 924 cm^-1，酰胺Ⅰ带的吸收峰为1 647 cm^-1。酰胺Ⅰ带的特征吸收波数通常在1 630～1 680 cm^-1，是由蛋白质多肽骨架的C=O伸缩振动产生，为蛋白质二级结构变化的敏感区，常被用于蛋白质的二级结构分析^[11]。该研究中提取的PSC符合酰胺Ⅰ带的出峰位置。胶原蛋白酰胺Ⅱ带的吸收在1 500～1 600 cm^-1，该研究中PSC酰胺Ⅱ带的吸收频率为1 552 cm^-1。PSC在1 212 cm^-1（酰胺Ⅲ带）和1 458 cm^-1均有吸收，表明海参胶原蛋白的螺旋结构保持较好^[12]。红外谱图分析结果表明在提取过程中胃蛋白酶仅水解胶原的非螺旋区，对螺旋区没有破坏。

图2 PSC的红外扫描图谱

3 小结

从海参中提取胶原蛋白及其水解物的方法有酸法、碱法、酶法、酸与酶的结合、碱与酶的结合。酸解法通常需要0.1 mol/L醋酸长时间浸泡，溶解量少，与胃蛋白酶联合使用，能提高溶解量，且蛋白酶水解胶原作用条件温和，所需设备简单，反应速率快，提取的水解胶原蛋白纯度高，水溶性好，理化性质稳定，所以该试验用碱、酶结合法提取蛋白质。

经胃蛋白酶消化法从海参中提取胶原蛋白，通过SDSPAGE电泳分析、氨基酸分析和红外谱图分析，所提取物为胶原蛋白，与文献报道相一致。

参考文献

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