吴超 毕可可 黄华枝 何世庆

摘要 [目的]探究香蕉防御酶与抗枯萎病之间的关系。[方法]以抗病品种粉杂一号和感病品种广粉一号为研究材料，测定了香蕉不同抗性品种接种香蕉枯萎病菌后根部防御酶活性的变化趋势。[结果]包括过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）在内的防御酶系活性的高低可以作为判断香蕉品种对枯萎病菌抗性的一个重要生理指标，而超氧化物歧化酶（SOD）与品种抗病性之间的关系则需进一步研究。[结论]试验结果为进一步揭示香蕉抗枯萎病的生理生化机制奠定了基础。

关键词 香蕉枯萎病菌;防御酶;酶活性;抗病性

中图分类号 S436.68+1  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2015）03-107-03

Analysis of Defensive Enzymes Activities of Banana Fusarium Wilt

WU Chao， BI Keke， HUANG Huazhi et al

（Guangzhou Academy of Forestry and Gardening， Guangzhou， Guangdong 510405）

Abstract [Objective] The aim was to understand the relationship between defense enzymes of banana and Fusarium wilt resistance. [Method] New resistant cultivar Fenza 1 and susceptible cultivar Guangfen 1 were used as materials， and the change trends of defense enzymes of banana after inoculating Fusarium oxysporum f sp. Cubense were determined. [Result] The activities of defense enzyme system including CAT，POD and PPO could be an important physiological index to judge the resistance of wilt disease of banana species. And the relationship between SOD and resistance still needed more research. [Conclusion] The results lay the basis for revealing resistant physiological and biochemical mechanism of banana to Fusarium oxysporum f sp. Cubense.

Key words Fusarium oxysporum f sp. Cubense; Defense enzymes; Enzyme activity; Resistance

香蕉枯萎病是香蕉生产上重要的病害之一，在世界上许多香蕉种植区都有发生，也是我国各香蕉种植区最严重的香蕉病害之一^[1]。香蕉镰刀菌枯萎病又称巴拿马病、巴拿马枯萎病、黄叶病，是一种毁灭性病害，由土壤真菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense（FOC）引起^[2]。香蕉枯萎病自1874年首次被報道后一直受到各国学者们的关注，并做了许多研究，但大多集中在病原菌上，包括病原菌形态学、生物学和遗传多样性以及病原菌的专化型和生理小种的鉴定、寄主范围以及病害发生流行和防治上，而关于香蕉对该病的抗性机理的研究报道甚少^[3-4]。

植物和寄生物相互作用中产生的化学物质是生理活性物质的基础^[5]。同时，植物的保护反应是复杂的新陈代谢的结果，植物对寄生物侵害的生理反应是以酶的催化活动来实现的。植物体内的保护酶系统就是保护机体免受自由基的伤害。植物组织内的CAT、POD、PPO、SOD等酶的活性大小反映了植株抗病性的强弱^[6]。鉴于此，笔者研究了香蕉不同抗性品种接种香蕉枯萎病菌后根部酶活性的变化趋势，以期为进一步揭示香蕉抗枯萎病的生理生化机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

香蕉枯萎病菌4号小种野生型菌株WT（XJZ2）由华南农业大学热带亚热带真菌研究室提供。抗病品种粉杂一号和感病品种广粉一号购自广东省农业科学院，选择生长一致、健壮的60 d苗龄的蕉苗供试。

1.2 方法

1.2.1 接种体的制备。

将香蕉枯萎病菌接种在PDA培养基上，25 ℃下培养10 d，把孢子洗入无菌水中配成浓度为1×10⁵个/ml孢子悬浮液，供接种用。

1.2.2 接种方法。

参照李敏慧等^[7]的伤根接种法，稍作修改。用直径0.7 cm的打孔器在25 ℃下培养5 d后的PDA平板上取菌龄、大小一致的菌碟，接种于含3 ml YPD、容量为50 ml的离心管中，每管3个菌碟，于25 ℃、200 r/min振荡培养2 d。每菌株设3次重复。培养结束后，用无菌水配制成1×10⁵个/ml的孢子悬浮液。选取长势一致、具4～5片叶的健康组培香蕉苗（粉杂一号和广粉一号），每个处理接种100株蕉苗，用自来水冲洗干净，适当伤根，在YPD孢子悬浮液中浸根接种30～60 min，以无菌水作阴性对照，然后移栽到盛有灭菌细砂的营养杯。置于温室内，平均最高温度32 ℃，最低温度25 ℃，每天浇水1次。采用随机区组设计，设置3个重复，用喷清水作空白对照。

1.2.3 取样。

待供试蕉苗接上菌后，分别于0、1、2、3、4 d取样，每个处理取样5株。用蒸馏水冲洗1次，置于纱布上晾干水分后，取假茎部位，于-80 ℃超低温冰箱内保存。

1.2.4 测定方法。

1.2.4.1 粗酶液的提取。

取试验材料0.5 g，加入5 ml 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0，含1% PVP）在冰浴上研磨后转移至离心管中，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，上清液即为酶粗提液，贮于-80 ℃冰箱备用。

1.2.4.2 CAT活性测定。

参考陈利锋等^[8]的方法，以每毫克鲜重每分钟OD值变化0.01为1个酶活单位（U）。

1.2.4.3 POD活性测定。

参照Schaffrath等^[9]的方法，以每毫克鲜重每半分钟 OD值变化0.01为1个酶活单位（U）。

1.2.4.4 PPO活性测定。

PPO与POD的提取方法相同，取“1.2.4.1”酶液0.2 ml（以沸水煮失活酶液为对照），加3.5 ml磷酸缓冲液、1.0 ml 0.1 mol/L邻苯二酚混匀后置于30 ℃水浴中反应30 min，立即用10%磷酸终止酶反应，用分光光度计于525 nm波长处测定吸光值，以OD₅₂₅值变化0.01为1个酶活力单位（U），酶活性以U/mg（FW）表示。每个样品重复测定3次。

1.2.4.5 SOD活性测定。

参照胡莉莉^[5]的方法，以抑制50%NBT光化还原为1个酶活单位（U）。

2 结果与分析

2.1 CAT活性的变化

由图1可知，从横向比较来看：未接种处理的抗感品种中，其CAT活性均表现为缓慢上升，且2个品种之间差别很小;而接种枯萎病菌后，香蕉假茎CAT活性变化，感病品种广粉1号酶活只有略微上升，而抗病品种粉杂1号酶活则迅速上升并出现2次峰值，分别出现在第1和第3天，其中第3天的峰值是对应感病品种的酶活的1.75倍。由此可以看出，接种后，CAT活性增幅的大小和次数与品种抗病性水平相吻合。

从纵向比较来看：对于感病品种广粉一号，接种后第1和第2天酶活略微比未接种的活性高;而对于抗病品种粉杂一号，接种后酶活出现2次高峰，其中第2次峰值的酶活显著高于未接种的酶活，而未接种的酶活只出现1次峰值。可以看出接种后，抗感品种的酶活均有不同程度的上升，但抗病品种上升的幅度更大，峰值更多，表明CAT活性在接种后被激发，且活性增幅大小与次数和抗病性呈正相关。

图1 未接种与接种的抗感品种香蕉假茎CAT活性变化

2.2 POD活性的变化

由图2可知，从横向比较来看：未接种处理的抗感品种中，其POD活性均表现为先上升后下降，并均在第2天达到峰值且峰值酶活差别很小;而接种枯萎病菌后，香蕉假茎POD活性变化，抗感品种POD活性均迅速上升并在第2天达到峰值，抗病品种比感病品种在峰值的酶活更高。由此可以看出，接种后，POD在峰值活性的大小与品种抗病性基本正相关。

从纵向比较来看：对于感病品种广粉一号，接种与未接种的酶活均在第2天出现峰值，前者酶活是后者的1.60倍;而对于抗病品种粉杂一号，接种与未接种的酶活也均在第2天出现峰值，但前者酶活是后者的2.30倍。可以看出，抗感品种接种与未接种酶活峰值的增幅与香蕉抗病性呈正相关。

图2 未接种与接种的抗感品种香蕉假茎POD活性变化

2.3 PPO活性的变化

由图3可知，从横向比较来看：未接种处理的抗病品种和感病品种中，其酶活随时间均缓慢上升，感病品种在第5天下降随后又上升;而接种枯萎病菌后，香蕉假茎PPO活性变化，感病品种酶活在第2天出现1个峰值而后下降;而抗病品种酶活则迅速上升，从第2天开始酶活出现高峰并保持一定的稳定性，其峰值酶活是感病品种中峰值酶活的1.33倍。由此可以看出，接种后，PPO活性增幅的大小和峰值保持时间与品种抗病性水平相吻合。

从纵向比较来看：对于感病品种广粉一号，接种与未接种的酶活均在第2天出现峰值，前者酶活是后者的1.20倍;而对于抗病品种粉杂一号，接种的酶活在第2天出现峰值并保持一定稳定性，未接种的酶活在第3天出现峰值随后便下降，且前者峰值酶活是后者的1.50倍。可以看出，抗感品种接种与未接种酶活峰值的增幅及出现的早晚和稳定性与品种的抗病性程度相吻合。

图3 未接种与接种的抗感品种香蕉假茎PPO活性变化

2.4 SOD活性的变化

由图4可知，从横向比较来看：未接种处理感病品种，其SOD酶活随时间均缓慢上升，抗病品种的酶活基本保持不变;而接种枯萎病菌后，感病品种酶活仍随时间均缓慢上升;而抗病品种酶活则略微上升后下降。由此可以看出，接种与否对感病品种酶活影响极小，抗病品种酶活却出现轻微变化，酶活变化与抗病性之间关联性不大。

从纵向比较来看：对于感病品种广粉一号，接种与未接种的酶活均随时间缓慢上升且各时间活性大小基本无变化;而对于抗病品种粉杂一号，未接种的酶活基本没有变化，接种的酶活在第2天出现一个极小的上升后下降。可以看出，无论是抗病品种还是感病品种，接种和未接种SOD变化均极小，表明SOD与品种抗感之间的关系不大。

图4 未接种与接种的抗感品种香蕉假茎SOD活性变化

3 讨论

植物的抗病生理生化机制很复杂，植物体内正常情况下保护酶系统处于平衡状态，而受病原物侵染后活性大大改變，表明植株体内保护酶系都是在与病原物的互作中，主要是经病原物诱导而起抗病作用。因而，在病原菌侵染初期测定保护酶含量的相对变化可以作为一个抗病指标，而正常植株酶活性的高低也可作为品种抗性筛选的指标之一^[10]。

该研究结果表明，活性氧清除酶系中，CAT和POD的活性变化程度与香蕉对枯萎病的抗性水平相吻合，而SOD酶活变化与抗病性之间关联性不大，所以它与品种抗性是否有关还需做进一步研究。CAT、POD和SOD共同组成植物体内一个有效的活性氧清除系统，三者协调一致地共同作用，能有效清除植物体内的自由基和过氧化物^[11]。而该研究结果证明，三者在香蕉对枯萎病的抗性上表现出来的变化并不一致，因此可以推断SOD的防御反应机制与其他2种酶不同。

CAT是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶^[12]。它可促使H₂O₂分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H₂O₂的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。在该研究中，抗感品种在未接种时植物组织的CAT酶活变化差别很小，而接种后，其活性增幅大小与次数则与抗感水平呈正相关，说明香蕉在未受到病原菌侵染时，抗感品种的植株均正常代谢，酶活水平会处在一个较低的平稳状态。而病原菌侵入后，抗感品种均遭受了病原菌对其不同程度的损伤，细胞活性氧促发，诱发植株体内CAT酶的活性升高，从而使细胞免于遭受H₂O₂的毒害。而抗病品种的CAT活性增幅更大，因此植物可以更好地抵抗病原菌的损伤，表现出抗病。综合该试验结果，CAT活性的高低可以作为判断香蕉品种对枯萎病菌抗性的一个重要生理生化指标。

POD广泛分布于植物体内，是细胞内一种重要的防御酶^[13]。POD除了在活性氧清除系统中发挥重要功能外，还参与了木质素的聚合过程，如植保素和乙烯的合成、脂肪酸和酚类物质的氧化^[14-16]。因此，POD活性的變化关系到植物体内很多生理生化反应的变化。该试验结果表明，香蕉在未接种病菌时，POD表现为先上升后下降，并均在第2天达到峰值且峰值酶活差别很小;而在接种后，抗感品种POD活性均迅速上升并在第2天达到峰值，抗病品种比感病品种在峰值的酶活更高，增幅更大。由此可以看出，接种后，POD峰值活性的大小及增幅与品种抗病性基本正相关。这些现象说明，在接种后，一方面，与CAT的情况相同，植物体内的活性氧促发，诱导POD活性升高，从而清除活性氧;另一方面，也说明植物在受到病原菌侵染后，POD的活性上升，木质素和乙烯的合成以及脂肪酸和酚类物质的氧化也开始变得更活跃，从而使植株的抗病性更强，而这一系列的反应在抗病品种中都更剧烈，因此表现为抗病性。所以POD活性可以作为香蕉抗枯萎病的一项生理生化指标。

SOD是一种金属酶，是植物体内保护酶系统的核心部分。具有清除自由基、保护蛋白质、保护细胞膜免受活性氧毒害的作用。1969年，McCord等^[17]第1次报道了从牛血红细胞中发现的超氧化物歧化酶的酶学特征，并证明其功能是清除O·-₂。之后在植物体中也发现了该种酶，其主要功能是将O·-₂歧化为H₂O₂（ 2O·-₂+2H→H₂O₂+O₂）。植物体中SOD主要以FeSOD、MnSOD和Cu/ZnSOD形式存在于细胞质、叶绿体、线粒体和过氧化物酶体中，金属离子位于酶活性中心，其存在与否直接影响酶活。SOD一部分是组成型表达，另一部分是诱导型或受生长发育调节的。植物-病原物互作中SOD活性发生变化，这种变化随不同互作类型和不同病害系统而异。在该试验中，未接种处理中，感病品种SOD酶活随时间缓慢上升，抗病品种的酶活基本保持不变;接种处理后，感病品种酶活仍随时间缓慢上升，而抗病品种酶活则略微上升后下降。由此可以看出，接种与否对感病品种酶活影响极小，抗病品种酶活却出现轻微变化，但酶活变化与抗病性之间关联性不大。说明在香蕉中SOD的作用机理比较复杂，它所催化的各反应与植株的抗感性并没有直接的联系。又可证明植株在被病原菌侵染后，所发生的生理生化反应不能成功地诱发SOD活性变化。因此，该试验SOD酶活测定的结果是否与香蕉品种抗枯萎病有关还需做进一步研究。

43卷3期                   吴 超等 香蕉枯萎病抗性防御酶的测定

PPO可催化醌和单宁的合成。醌和单宁对病原菌菌丝的生长具有毒性，酚类化合物是细胞形成木质素的前体物质，PPO可催化木质素的形成，促进细胞壁木质化以抵抗病原菌的侵染^[18]。在该试验中，未接种植株体内抗、感2个品种PPO活性均已经有略微上升，感病品种在第5天下降后又上升，说明未接种的对照植物由于也进行了轻微的伤根处理，所以会合成少量酚类物质，诱发植物的“愈伤反映”，PPO活性略微增强，促进了酚类物质的氧化，增强了植株的抗逆性。在接种后，感病品种酶活在第2天出现1个峰值而后下降，而抗病品种酶活则迅速上升，从第2天开始酶活出现高峰并保持一定的稳定性，其峰值酶活是感病品种中峰值酶活的133倍。由此可以看出，PPO活性峰值增幅的大小和峰值出现早晚及稳定性与品种抗病性水平相吻合。这说明接种后，植物体内的酚类物质大量合成，更强烈地诱发了PPO活性上升，大量地催化氧化酚类物质，而该类物质可以抑制病菌孢子萌发和菌丝生长并钝化病原菌产生的毒素^[19];另一方面，它们是植保素合成的前体，增强了植株木质化过程，加强植物对病原菌生化和物理防御。而在抗病品种中，PPO活性更强烈持久，从而帮助植株强有力地抵抗了病原菌的侵染。表明PPO与香蕉品种抗病性有重要关系，可以作为鉴定香蕉抗枯萎病能力强弱的一项生理生化指标。

综上所述，2个品种香蕉接种枯萎病菌后体内CAT、POD、PPO活性变化可以作为香蕉抗枯萎病的一项生理生化指标，而SOD还有待于进一步研究。另外，由于该研究所使

用的香蕉品种较少，得到结果可能存在一定偏差，还需在更多香蕉品种上进行研究，而且接种后香蕉体内各种酶活性发生变化是现象还是本质，对于香蕉抗枯萎病的机制非常重要。

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