乔婵 万秀清 李若 魏亭宇 吴国顺 都兴洋 黄磊

摘要

[目的]筛选与鉴定烟草抗PVY病突变体，为寻找抗PVY的基因奠定基础。[方法]通过苗期对烟草突变材料进行PVY接种鉴定，肉眼对材料进行初步筛选，对筛选到的抗性材料进一步荧光定量鉴定，对筛选鉴定的抗性材料进行苗期鉴定及田间抗性鉴定。[结果]2011年筛选获得2个高抗PVY的突变体MZE215和MZE216，以及3个耐PVY突变体MZE270、MZE2207及MZE2228;2012年进一步筛选鉴定，突变体材料MZE2407和MZE2428感PVY，MZE216和2份MZE215突变体材料抗PVY。[结论]试验结果为控制烟草PVY病的危害提供了理论依据。

关键词 烟草;PVY;突变体

中图分类号 S572  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2015）03-099-03

Selection and Identification of Tobacco Mutants with PVY Resistance

QIAO Chan， WAN Xiuqing*， LI Ruo et al

（Mudanjiang Tobacco Research Institute，Mudanjiang， Heilongjiang 157011）

Abstract [Objective] Tobacco mutants with PVY resistance were selected and identified to lay the basis for finding PVY resistant genes. [Method] Different tobacco mutants were inoculated with PVY in seedling stage and were preliminarily selected by nakedeye observation. Enzymelinked immunosorbent assay （ELISA）， realtime fluorescence quantitative PCR and test strip assay were performed to further identify preselected mutants. Finally， resistance of these identified mutants was evaluated by pot culturing in green house and in the open field. [Result] Two mutants MZE215 and MZE216 showing high PVY resistance and three mutants MZE270， MZE2207and MZE2228 with tolerant PVY resistance were obtained in 2011. These mutants were further identified in 2012， and results showed that MZE2407 and MZE2428 were PVY susceptible， whereas MZE216 and MZE215 were PVY resistant. [Conclusion] The results provide theoretical basis for the control of tobacco PVY.

Key words  Tobacco; PVY; Mutants

基金项目 国家局烟草基因组计划重大专项突变体项目[110201201004（JY04）]。

作者簡介

乔婵（1978-），女，黑龙江双城人，农艺师，硕士，从事烟草分子生物学和病理学研究。*通讯作者，高级农艺师，硕士，从事烟草分子生物学和病理学研究。

收稿日期 20141203

烟草PVY病又称为叶脉坏死病、烟草脉帯病、黄斑病，是能系统侵染烟草的病害^[1-2]。烟草PVY病在我国分布广，危害重，对烟草生产的危害正逐年加重，近年来更是在多个烟区呈急剧上升趋势，已成为危害我国各烟区烟草的主要病毒病害之一^[3-4]。烟草一旦感染PVY，整片叶子几乎失去烘烤价值，严重情况下烟茎坏死、叶片坏死，每公顷产值减少11%～18%;除影响产量外，被PVY侵染后的烟叶全氮含量增加，烟碱含量升高，尼古丁含量增加，糖氮比降低，还原糖减少，烤晒后的色泽及气味等品质均大大降低，烟叶等级指数也降低36%～62%^[5-6];PVY侵染烟草引起的PVY病严重影响烟叶的产量和质量，并造成较大的经济损失，严重影响烤烟生产的可持续发展^[7]。

烟草基因组重大专项项目“烟草突变体库创制、筛选与分析”实施以来，通过化学和生物学方法创制和收获了15万份烟草突变二代种子，建立了10个表型筛选方法和2个序列筛选方法^[8]。笔者以此为基础，开展了烟草抗PVY病突变体筛选与鉴定，旨在为控制烟草PVY病的危害提供理论依据。

1  材料与方法

1.1 材料

230份中烟100的EMS突变材料（山东省青州烟草研究院提供），PVY抗性对照品种VAM，PVY感病对照品种NC95。LJ925（抗TMV，感PVY）接种毒源。PVY检测试纸条及PVY株系检测试剂盒;分子生物学试验试剂材料。

1.2 方法

1.2.1

PVY毒源的采集、鑒定及繁殖。

1.2.1.1

毒源的采集。从黑龙江省哈尔滨烟叶产区和牡丹江烟叶产区采集疑似PVY样品，置于冰箱冷冻保存。

1.2.1.2

毒源的分子鉴定。通过从Genbank上下载的PVY各株系序列的比对，设计合成PVY通用鉴定引物，引物设计于P1基因，PCR扩增片段为730 bp左右; 10.0 μl的PCR扩增体系为：2.5 mmol/L dNTPs 1.0 μl， 10× PCR buffer 1.0 μl， Taq酶0.2 μl，引物各0.5 μl，超纯水5.8 μl，菌液模板1.0 μl。PCR扩增条件：94 ℃预变性10 min; 94 ℃变性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.2 min，循环36次;72 ℃延伸10 min。引物序列：PVYF，5TGC/TTA/TCCA/GTACTCACCC/AGC3;PVYR，5′CCACG/ACACTATGAAT/CAA/GGCC3′。利用该引物对保存的毒源进行鉴定，对特异条带进行回收测序。

1.2.1.3

PVY毒源的繁殖。将通过生物学鉴定方法分离出纯的PVY病毒烟叶剪成碎片研成汁液，加入汁液体积10倍的PBS缓冲液（pH 7.27）。在烤烟品种LJ925烟草团棵期，选取中上部2片叶子进行病毒摩擦接种，接种20 d左右表现明显的PVY症状。

1.2.2

突变体烟苗种植方法。

2011年4月8日播种230份突变体材料种子、感PVY的烟草品种NC95和抗PVY的烟草品种VAM作为对照品种，2011年5月4日假植，每份材料假植20株，NC95和VAM各假植2盘。

1.2.3

苗期PVY接种鉴定方法。在烟苗4片真叶时期（2011年5月23日），采用毛刷蘸取新鲜PVY汁液进行接种，接种后20 d烟苗显症，以抗病品种VAM外观形态及感病品种NC95 PVY症状为对照，拔除感病的烟苗（2011年6月15日），剩余未显症烟苗喷肥后继续观察，7～10 d后第2次将感病烟苗拔除（2011年6月26日）。剩余没有明显PVY症状的烟苗成苗后移栽至大田进行进一步鉴定。

1.2.4

大田期PVY接种鉴定方法。经苗期筛选后移栽至大田的烟苗，生长至团棵期后接种PVY病毒，接种方法同“1.2.3”。接种后20～30 d以抗病品种VAM外观形态及感病品种NC95 PVY症状为对照，调查各材料发病情况，现蕾期对没有明显PVY症状的烟苗套袋留种。

1.2.5

PVY抗性材料抗性遗传稳定性鉴定方法。

对2011年最终筛选出的5份无PVY症状及症状不明显的突变体材料在2012年进行进一步的筛选鉴定。2012年3月30日对5份材料进行播种，2012年4月19日假植，每个材料假植1盘。2012年5月14日利用繁殖的PVY毒源第1次进行苗

期PVY接种，2012年5月27日第2次进行苗期PVY接种，

2012年6月18日进行移栽，每个材料选择无明显PVY症状的烟苗移栽24株，田间正常农业管理。

2 结果与分析

2.1 PVY毒源的采集样品、分子鉴定及繁殖样品

2.1.1

PVY毒源的采集样品。采集的毒源样品见图1。

图1 采集的毒源样品

2.1.2

PVY毒源的分子鉴定。毒源测序比对结果如下：

利用设计的引物对繁殖的PVY毒源及其他保存的毒源进行了鉴定，对特异条带进行了回收测序。由表1可知，该毒源与PVY NE11分离物具有99%的同源性，证实为PVY病毒。

2.1.3

PVY毒源的繁殖样品。PVY突变体繁殖的毒源见图2。

2.2 PVY突变体材料苗期及大田期筛选鉴定

2.2.1

PVY突变体材料苗期筛选。

230份突变体材料，其中有3份材料未发芽，其他材料生长良好（图3～6）。苗期经过观察筛选，最终筛选出314株突变体材料进行田间种植。

2.2.2

PVY突变体材料大田期筛选鉴定。

将苗期筛选出的烟苗进行田间种植，在团棵期进行了PVY症状调查，筛选出16株无PVY症状或症状不明显的烟苗，对其重新进行PVY接种，8月末再次进行PVY调查，最终筛选出5份无PVY症状及症状不明显的烟苗，其中2份基本看不到任何PVY症状，另外3份症状较轻（图7～9）。其中，MZE216、MZE215达到高抗，MZE270及MZE2407达到中抗水平，MZE2428为中感。利用RTPCR方法对上述几份材料进行PVY病毒检测，结果表明各样品均感染PVY病毒，只是程度有所不同。

2.2.3

大田期PVY抗性稳定性鉴定结果。

2012年7月23日进行田间PVY抗性调查。由表2可知，5份突变体材料都移栽了24棵，其中MZE2428存活的棵数最少，为14棵，MZE216存活的棵数最多，为21棵;从抗病性来看，突变体材料MZE2407（图10）和MZE2428出现了感PVY的症状，MZE216和2份MZE215（图11）突变体材料对PVY病毒具有抗性。因为该次试验的PVY株系致病性较强，导致烟苗死亡的发生。

3 讨论

烟草感染PVY后，因品种和病毒株系的不同所表现的

病状特点亦有明显差异，所以对于PVY毒源的选择也很重要，要选择点刻条斑症的毒源，该种毒源发病初期病叶先形成褪绿斑点，之后叶肉变成红褐色的坏死或条纹斑，叶片呈青铜色。是PVY区别于其他病害独有的症状，利于接种后烟株的观察和选择，以防误判，影响最终突变体的筛选。

烟草苗期（4叶期）接种PVY后，症状一般在15 d左右显现，症状是否明显与烟苗的营养状况有直接关系，烟苗萎

蔫、弱小、黄化等均不利于症状观察，因此需要加强苗期管理，保证烟苗不脱水、脱肥（10 d左右喷施一次烟草叶面肥），但过量的水肥会造成烟苗根部滋生真菌，需要密切注意。一般可考虑10 d左右喷施一次烟草叶面肥。另外，要防止烟苗发生其他病害（野火病、炭疽病、TMV等），这些病害也会给PVY症状鉴定带来影响。

参考文献

[1]

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[2]  高正良.烟草马铃薯Y病毒（PVY）的研究现状与防治对策[J].安徽农学通报，2003，9（5）：75-77.

[3]  朱贤朝，王彦亭，王智发.中国烟草病虫害防治手册[M].北京：中国农业出版社，2002：48.

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[8]  刘贯山.烟草突变体的筛选与鉴定[J].中国烟草科学，2012（33）：102-103.