李文龙 王媛媛 张芳芳 刘淑静 刘宇 张东吉 张跃华

摘要 阐述了发根农杆菌的作用机理，对毛状根诱导过程中外植体、发根农杆菌种类、预培养及共培养时间、外源激素添加、酚类物质添加及培养条件等因素对诱导率的影响进行系统的论述，并对药用植物毛状根的鉴定方法及在次生代谢物的合成机制研究及生产、药用植物基因工程、新药物的产生、药物蛋白生产等方面的应用进行概述。

关键词 药用植物;发根农杆菌;毛状根

中图分类号 S567  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2015）03-044-03

Study on Hairy Roots of Medicinal Plant Technology

LI Wenlong¹， WANG Yuanyuan¹， ZHANG Fangfang¹， ZHANG Yuehua2* et al

（1. College of Life Sciences of Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007; 2. Faculty of Science， Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007）

Abstract This paper describes the action mechanism of Agrobacterium rhizogene，effects of explants， Agrobacterium rhizogene species， preculture and coculture time， exogenous hormones， polyphenols and culture conditions on the induction rate during hairy roots induction process were elaborated. The identification method of medicinal plants hairy roots， and the application in synthesis mechanism and production of secondary metabolites， the medicinal plant gene engineering， development of new drugs， pharmaceutical protein production were reviewed.

Key words Medicinal plants; Agrobacterium rhizogenes; Hairy roots

基金项目 佳木斯大学校长创新创业基金项目（xzyf201308）。

作者简介 李文龙（1990- ），男，山东曹县人，本科生，专业：生物技术。*通讯作者。

收稿日期 20141205

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）是一种土壤细菌，具有广泛侵染性，能够诱导植物形成毛状根，Hildebrand于1934年在对苹果树的研究中阐述了该现象^[1]。发根农杆菌携带的Ri质粒侵染植物后，双子叶植物大多数能够诱导出毛状根，而单子叶植物只有少数能够在感染部位长出毛状根。发根农杆菌诱导产生的毛状根具有次生代谢物高且可以稳定存在，还具有生长速度快和易获得再生植株等优点。毛状根技术被应用于药用植物的研究，成为药用植物研究的一个新方向。

1 发根农杆菌作用机理

发根农杆菌上含有一个巨大的侵入质粒——Ri质粒，大小为200～800 kb，其上含有2个与转化有关的区域：Vir区（致病区）和TDNA区（转移区）。发根农杆菌作用于药用植物，感染后可在伤口部位诱导出毛状根就是由发根农杆菌Ri质粒上的TDNA区和Vir区来实现的。在自然状态下，发根农杆菌上的Ri 质粒作为基因载体可以直接作用于药用植物伤口处细胞;在药用植物伤口组织处会产生乙酰丁香酮等酚类化合物及多糖物质，能够诱导Ri质粒内vir基因表达;vir基因表达产物再作用于TDNA区，使TDNA区的DNA片段能插入整合到药用植物的基因组，DNA片段整合到宿主细胞后表达，促使伤口处组织分化产生大量毛状根^[2]。

2 藥用植物毛状根诱导及鉴定

药用植物毛状根诱导常用的方法有3种，即直接接种法、外植体共培养法、原生质体共培养法。直接接种法：利用药用植物种子获得无菌苗，在茎上划出伤口，将活化好的农杆菌接种到伤口上，继续培养一段时间后就会从伤口处长出毛状根，此种方法最为简单便捷。外植体共培养法：取药用植物的叶片、叶柄或茎段等无菌外植体与活化好的发根农杆菌进行共培养，共培养2～3 d后，在加有抗生素的培养基上继代培养，除掉发根农杆菌，一段时间后在外植体切口处长出毛状根。原生质体共培养法：获得药用植物原生质体，与活化好的发根农杆菌共培养，然后在加有抗生素的培养基上筛选，最后在分化培养基上获得完整毛状根或植株，该方法对原生质体要求高且筛选和除菌较麻烦。

诱导出的药用植物毛状根大多具有分支多、大量白色根毛、失去向地性生长、液体培养速度快于正常根的特点，因此，可以根据毛状根的特性从形态学水平上对毛状根进行鉴定。药用植物被感染细胞将发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA整合后，在细胞内会形成特异的冠瘿碱，利用硝酸银试剂或磷钼酸试剂染色法和高压纸电泳法^[3-6]检测药用植物毛状根中是否含有冠瘿碱，从细胞水平上判断是否转化成功。此外，还可以利用PCR扩增技术从分子水平上对诱导出的毛状根进行鉴定。

3 影响毛状根诱导的因素

3.1 外植体

在药用植物毛状根诱导时，外植体的选取十分关键。同一种发根农杆菌感染，不同药用植物同一外植体或同种药用植物的不同外植体及同一药用植株的不同发育阶段的外植体转化率都存在显著差异。同一种发根农杆菌对同属植物不同植株的同一外植体进行感染，转化效率由于植株种类存在明显差异。刘传飞等^[7]在发根农杆菌对同属植物作用的研究中，用R1601菌株同时感染3种葛属植物，发现三裂叶葛、野葛和山葛叶片毛状根的诱导率分别为28%、15%和17%。同一种发根农杆菌感染同种药用植株时，一般叶片的转化率会高于茎和叶柄，幼嫩植物组织器官的转换率会高于发育成熟的植物组织器官。王莉等^[8]在何首乌毛状根培养的研究中，利用发根农杆菌LBA9402对何首乌叶、叶柄和茎切段分别进行感染，结果发现叶柄和茎的诱导率分别为66.7%和46.7%，而叶的诱导率高达100%。胡忠等^[9]在枸杞发根农杆菌转化系建立的研究中发现，枸杞的毛状根诱导频率与外植体的发育年龄和生理状态密切相关。

3.2 菌株种类

不同菌种的发根农杆菌对于同种药用植物转化率不同。刘峻等^[10]在人参Ri质粒转化系统建立的研究中，分别使用发根农杆菌15834、LBA918、A4、R1000、1601感染人参外植体，结果有15834菌株可诱导出人参毛状根，证明不同发根农杆菌菌株对同一药用植株致根能力不同。一般发根农杆菌中的碱型菌比甘露碱型菌株具有更广泛的寄主范围，如LBA9402、A4、1601、8196、15834等常用的碱型菌。Hamill等^[11]利用发根农杆菌碱型菌株LBA9402进行诱导试验，结果发现双子叶植物大多都能诱导产生毛状根。

3.3 预培养及共培养时间

药用植物外植体在感染发根农杆菌之前，接种到空白培养基预培养一定时间，可以提高转化率并解决外植体伤口处细胞因过敏反应导致的褐化问题。因为在预培养过程中，外植体伤口能够形成乙酰丁香酮等物质并释放出诱导发根农杆菌识别的信号分子。TDNA由发根农杆菌Ri质粒上转移并整合到受感染细胞DNA上需要一定的时间，所以，外植体与发根农杆菌共培养时间的长短直接影响到毛状根的诱导率。在诱导药用植物毛状根时，要适当延长共培养时间，以提高转化频率。共培养时间过短，Ri质粒上的T-DNA还不能完成转移与整合，则无法得到转化的毛状根;共培养时间过长，发根农杆菌增长过量易导致植物组织死亡。孙敏等^[12]在长春花转化毛状根诱导的研究中发现，当预培养2 d时转化频率最高达到44.44%，当共培养2 d时转化频率最高达到50.70%。

3.4 外源激素

药用植物毛状根诱导时，在培养基中加入一定量的外源激素，会使外植体伤口处细胞对发根农杆菌比较敏感，从而提高转化频率。刘峻等^[10]在人参毛状根系转化系统研究中发现，外植体在含NAA 3×10-6 mg/L、KT 0.3×10-6 mg/L的培养基中愈伤化程度最高，转化频率也最高，达到58%。王冲之等^[13] 在Ri质粒转化西洋参的研究中发现，西洋参外植体在添加2，4D 1 mg/L、KT 0.1 mg/L的MS琼脂培养基上培养，难以诱导出毛状根，而在添加NAA 6 mg/L的MS琼脂培养基中共同培养，成功诱导出毛状根。

3.5 酚类物质

毛状根诱导发生过程中，植物外植体的伤口处会分泌某些酚类物质，这些酚类物质能够引起Vir区基因的活化，从而提高毛状根的转化频率。因而，可以人为地在诱导过程中加入促进转化的酚类物质来提高转化频率。目前广泛使用的酚类物质有乙酰丁香酮、香草酚、羟基乙酰丁香酮等。添加适量的乙酰丁香酮可以提高转化频率，但对有些药用植物诱导不仅无效且会有毒害作用。刘峻等^[10]在进行人参转化系统的研究中发现，植株幼茎经1×10-4 mol/L的乙酰丁香酮处理后，转化频率明显提高。

3.6 培养条件

在毛状根诱导过程中，温度和光照也是重要的外界影响因素。发根农杆菌的增殖和活力对外界温度变化十分敏感。25～30 ℃发根农杆菌的增长最快，在28 ℃时，vir基因表达能力最强，适当调节温度，可以提高转化频率。毛状根诱导过程中光照时间的长短也会影响诱导率，大多数植物毛状根的诱导在黑暗条件下进行，而黄遵锡等^[14]研究发现紫苑毛状根在12 h/d光照条件下的诱导频率比黑暗条件下高，在全天24 h光照条件下短叶红豆杉毛状根的诱导效果最佳。

3.7 其他因素

药用植物毛状根诱导频率除以上几种因素外，还受到其他因素的影响。MS、LS等高盐培养基有助于毛状根的形成;培养基中糖类物质的含量会影响毛状根的诱导率;超声波和真空渗透处理药用植物材料能增加农杆菌与药用植物外植体之间的接触面积，提高转化频率;适当的菌种浓度也会提高转化频率，发根农杆菌菌种浓度在660 nm下的吸光度为0.5～0.8时，转化频率显著提高;共培养后除菌时抗生素种类和浓度的不同对转化频率有一定的影响;培养基的pH及NH₄NO₃含量对毛状根的转化频率也有一定的影响。

4 药用植物毛状根的应用

20世纪80年代毛状根技术出现后受到高度重视，90年代起，药用植物毛状根的研究开始趋热。统计数据表明，成功诱导出毛状根的药用植物已有近百余种，其中76%为草本植物，7%为藤本植物，其余17%为木本植物。近十几年来，人们不仅从人参、丹参、甘草、青蒿等数十种药用植物中诱导出毛状根，而且對培养条件、基因导入机理及有效药用成分含量进行了较为系统的研究。药用植物起药效作用的一般都是其次生代谢产物，药用植物的毛状根具有次生代谢产物含量高且稳定、生长快的特点，且毛状根可以产生生物碱、蔡醒、皂普、葱酿、多糖类、蛋白等代谢产物。药用植物毛状根主要应用在次生代谢物的合成机制研究及生产、药用植物基因工程、新药物的产生及药物蛋白生产。