金莹 房保海 刘新亮 孙涛 贾俊涛 赵丽青 孙雯娴

摘要  [目的] 建立一种通过焦磷酸测序技术检测大豆过敏原成分的方法。[方法]针对大豆GlymBd30K基因设计特异性PCR引物和焦磷酸测序引物，利用设计的特异性引物扩增各测试材料的特异基因片段并进行焦磷酸测序。 [结果]该检测方法对大豆过敏原成分具有非常好的重现性和特异性，测序结果在GenBank中进行同源性比对分析，表明目标序列能够作为鉴定GlymBd 30K基因很好的序列。[结论]为食品中的大豆过敏原成分快速检测提供很好的技术支撑。

关键词 焦磷酸测序;大豆;过敏原;PCR

中图分类号 S188  文献标识码

A  文章编号 0517-6611（2015）03-029-03

The Detection of Allergen GlymBd 30K in Soybean by Pyrosequencing Technology

JIN Ying¹， FANG Baohai2*， LIU Xinliang³et al

（1.Huangdao Exit & Entry Inspection and Quarantine Bureau， Qingdao， Shandong  266555; 2.Inspection and Quarantine Technical Center of Shandong Exit & Entry Inspection and Quarantine Bureau， Qingdao， Shandong  266002; 3. Heilongjiang Exit & Entry Inspection and Quarantine Bureau， Haerbin， Heilongjiang  150001）

Abstract  [Objective]To establish a rapid method to detect soybean allergens by pyrosequencing technology. [Method] The conserved sequences for GlymBd30K gene specific PCR amplification， and then using pyrosequencing technology for PCR amplification products.Using primers design specific gene fragments in tested materials were amplified， and then pyrosequencing. [Result] The results had very good reproducibility; the sequencing results were homology found in GenBank. The target sequence to sequence as the identification of GlymBd 30K gene was very good.[Conclusions] A simultaneous quantitative detection of 96 samples by pyrosequencing rapid detection methods was Successfully established， it will provide good technical support for rapid detection of allergens for export soybeans and their products.

Key words  Prosequencing;Soybean;Allergen; PCR

基金項目 国家质检总局项目（2011IK221）。

作者简介 金莹 （1981- ），女，山东沂水人，农艺师，博士，从事食品安全方面的研究。*通讯作者，高级工程师，博士，从事食品安全检测技术研究。

收稿日期 20141211

大豆是一种常见的食品过敏原，被称为八大类食品过敏原之一，美国、欧盟等都要求在食品标签中强制性标识。大豆GlymBd 30K蛋白是大豆的主要过敏蛋白，也被称为P34蛋白或30K，广泛存在于所有大豆品种中。研究表明，65%的大豆过敏症状都是由GlymBd 30K蛋白引起的，因此GlymBd 30K蛋白被视为大豆蛋白中一个重要的免疫显性过敏原^[1-3]。早在1998年Takano就在NCBI数据库中提交了大豆GlymBd 30K的DNA序列（AB013289），而2006年研究者^[4]在NCBI的核酸数据库中提交了大豆GlymBd 30K的mRNA序列（DQ324851）。目前，已有研究建立了ELISA 法、 PCR 法等方法检测过敏原大豆成分，然而这些方法存在一些不足之处，如蛋白质耐热性差，不适宜于现场快速检测等缺点。

焦磷酸测序技术（Pymsequencing） 是1998年发明的一种依靠生物发光进行的实时DNA测序技术，是由4种酶催化同一反应体系中的酶级联化学发光反应，适于对已知短序列的测序分析，无需荧光标记引物或核酸探针，无需电泳，具有分析结果快速、准确、灵敏度高、经济、自动化和实时检测的特点^[5]。笔者首次建立大豆GlymBd 30K基因的焦磷酸测序快速检测方法，为我国进出口大豆及其制品的过敏原快速检测提供很好的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆来源于山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心检验的进境大豆样品。

绿豆、赤豆、豇豆、豌豆、蚕豆、芸豆、扁豆、花生等均购自当地超市。

PCR扩增引物（金斯瑞生物科技公司合成）：上游引物Bd 30KF2 5′ GCGGATGGTGTAGATTACTGGA 3′;下游引物eBd 30KR2 5′ ACCTTTAACGCGAGCAGACA 3′ ，5′端标记生物素，扩增长度188 bp。

焦磷酸测序引物（金斯瑞生物科技公司合成）：Bd 30KS2 5′ CAAAGAAACACGGGTAA 3′;测序得目标序列为TTTATTAGGAGTGTGTGGGATGAATTATTTGCTCACTACCC。

2×GoTaq Master Mix PCR体系购自天根生化科技有限公司，50 bp和100 bp DNA Ladder Marker，均购自大连宝生物公司;焦磷酸测序试剂盒购自BD公司，试剂盒包括焦磷酸测序用酶、底物及各种dNTP、链酶亲和素磁珠、绑定缓冲液、复性缓冲液、变性缓冲液、洗液。

1.2 仪器与设备

普通PCR仪（Mastercycler gradient）（德国 Eppendorf 公司）;电泳仪 （DYY6C），北京六一仪器厂;离心机（德国 Eppendorf 公司）：离心速度12000 r/min以上 ;冰箱：（4～10 ℃、-20 ℃）;微量可调移液器（德国 Eppendorf 公司）：10、100、200、1 000 μl;PyroMark ID检测系统（瑞典Biotage公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA模板的制备。样品处理：取大豆等试验材料100 g，用灭菌洁净研钵或合适的粉碎装置将样品充分研磨混匀备用。

DNA模板的提取采用CTAB 法^[6]：取 200 mg 样品于 50 ml 离心管中，加入 5 ml CTAB 提取缓冲液和 20 μl 蛋白酶K 溶液，充分混匀。 65 ℃振荡过夜后，13 000 r/min 离心 20 min，转移上清液700 μl至新的离心管中;加入 700 μl 三氯甲烷后用力振荡，13 000 r/min 离心 5 min， 将上清转移到新的2 ml eppendorf离心管中;加入 2 倍体积的 CTAB 沉淀液，室温静置 60 min，13 000 r/min 离心 5 min，弃去上清。加入 350 μl NaCl 溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μl 三氯甲烷，涡旋振荡进行混匀，13 000 r/min 离心 10 min。转移上清到新的2 ml eppendorf离心管中后加入 0.8 倍体积的异丙醇，室温放置 60 min，13 000 r/min 离心 10 min，弃去上清。加入 500 μl 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于100 μl TE 溶液中，立即使用或-20 ℃保存备用。

1.3.2 PCR扩增。PCR反应体系：2×GoTaq Master Mix 25 μl，生物素标记上游引物和下游引物各10 pmol，DNA模板2 μl，加无菌去离子水至50 μl。扩增反应参数：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，50个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保温。取反应产物5  μl上样，2%琼脂糖凝胶电泳观察结果，其余扩增产物用于焦磷酸测序。

1.4 焦磷酸测序 ①将PCR产物转移至96孔PCR板中，在产物中分别加入Sepharose beads 3 μl和Binding Buffer 47 μl，常温混匀10 min。

②打开真空泵，将磁珠抓取臂（Vacuum Prep T001）在超純水中清洗30 s后移至96孔PCR板中，抓取磁珠，分别在70%乙醇中清洗5～10 s，变性缓冲液中变性5 s，洗液中清洗5～10 s。关闭真空泵，将磁珠释放入96孔测序板中，该板中预先加人测序引物0.3 μmol/L和复性缓冲液共45 μl。

③将96孔测序板置80 ℃温箱2 min，冷却至室温后进行焦磷酸测序反应。设定程序，碱基的加入为ATCG 6～10个重复，根据程序给定剂量（该剂量根据样本数的多少而定，由仪器程序自动给出），在试剂舱中加入酶混合物、底物混合物以及4种dNTP，将试剂舱和96孔测序板放入机箱中进行反应。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增引物特异性检测

利用设计引物扩增各测试材料的特异基因片段，电泳结果显示，只有大豆样品能够扩增出特异性基因片段188 bp，片段长度与引物设计的预期片段长度大小一致;绿豆、赤豆、豇豆、豌豆、蚕豆、芸豆、扁豆、花生均无扩增条带出现（图1和2），说明引物能够对大豆特异性扩增。

注：1.绿豆;2.赤豆;3.豇豆;4.蚕豆;5.50 bp ladder marker;6.大豆;7.芸豆;8.扁豆;9.花生;10.豌豆。

图1 PCR扩增引物特异性检测

注：M.100 bp ladder marker。

图2 部分实验室大豆样品PCR特异性扩增结果

43卷3期               金 莹等 焦磷酸测序技术检测大豆过敏原成分GlymBd 30K基因

2.2 样品焦磷酸测序结果

对13个进口大豆样品的PCR扩增结果均进行了焦磷酸测序，测序结果（图3）为TTTATTAGGAGTGTGTGGGATGAATTATTTGCTCACTACCC，具有非常好的重现性。

2.3 焦磷酸测序目标序列同源性分析 对测序结果在genbank中进行同源性比对，结果（图4）表明目标序列与大豆过敏原GlymBd 30K基因（P34）聚为一簇，能够作为鉴定GlymBd 30K基因很好的序列。

3 结论

该研究建立的焦磷酸测序技术吸收了PCR和DNA测序技术两方面的优势，在PCR特异性的基础上，应用很短的一段保守/特异序列的测定即可满足检测的需要。

该研究对豆科植物和13个进境大豆样品进行了PCR特异性扩增和焦磷酸测序研究，结果显示，PCR扩增具有特异性，所建立大豆过敏原基因Glym Bd 30K焦磷酸测序方法能够快速对目的基因进行测序，尚未出现假阳性和假阴性结果，具有较高的特异性。该方法具有快速、稳定性好、灵敏、特异高的特点。焦磷酸测序技术作为一种短片段测序方法，操作简单方便，可程序化，能够很好地保证测序结果的稳定性和准确性，另外该方法检测速度快，40 min内即可准确、实时地测定出96个样品目的片段的基因序列，可满足快速检测的需求，具有不可替代的作用。

参考文献

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[4] SAMOTO M，FUKUDA Y，TAKAHASHI K，et al.Substantially complete removal of three major allergenic soybean proteins （ Gly m Bd 30K，Gly m Bd 28K and the alpha subunit of conglycinin ） from soy protein by using a mutant soybean，Tohoku 124[J].Biosci Biotechnol Biochem，1997，61：2148-2150.

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安徽農业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2015，43（3）：50-51，54