徐洪伟　冷青云　覃海燕　赖杭桂　尹俊梅

摘 要 与无性多倍化相比，2n花粉在三倍体育种方面有明显优势。为了在红掌育种中使用2n花粉，本研究对红掌肉穗花序发育过程的小孢子母细胞减数分裂进行观察。以前期I为诱导时机，使用秋水仙素溶液棉浸法对红掌肉穗花序进行诱导，观察到二分体和三分体，获得了加倍的2n花粉。在小孢子母细胞第二次减数分裂过程中，观察到融合纺锤体，三极纺锤体和加倍的4n小孢子母细胞与2n花粉形成有直接关系。

关键词 红掌；减数分裂；2n花粉；秋水仙素诱导

中图分类号 Q945 文献标识码 A

Abstract Compared with mitotic polyploids， 2n pollens are useful for triploid breeding. For further use of 2n pollens in Anthurium andraeanum breeding， we observed the cytological process of meiosis of the pollen mother cell. Moreover， 2n pollen induction was performed with ‘Dakotaanther at the stage of prophase I via treated with 0.3% colchicine+2%dimethyl sulfoxide（DMSO） for 3 days. Our results showed that 2n pollens were induced after treated with colchicines， with triads and dyads. Furthermore， tripolar spindles， fused spindles in male meiosis II and 4n pollen mother cell were produced， which may have related to the formation of 2n pollens.

Key words Anthurium andraeanum；Meiosis；2n pollen gametes；Colchicine induction

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.11.021

紅掌（Anthurium andraeanum），又名火鹤花，隶属于天南星科，原产于哥伦比亚和厄瓜多尔，体细胞含30条染色体（2n=30）[1-2]。红掌是仅次于热带兰花的全球第二大热带花卉，在全世界有着广泛的分布和栽培，是研究最深入的花卉之一；红掌植株能有效吸收空气中的甲醛、二甲苯、甲苯、氨气等有毒气体[3]，对净化室内环境和美化生活具有积极意义，因而备受青睐。红掌基因组具有高度的杂合性，其减数分裂过程往往伴随着复杂的染色体行为[2]。减数分裂是物种有性生殖和遗传重组的基础，在物种进化过程中发挥重要作用[4]。

基因组加倍（多倍化）在植物进化和多样化中起到非常关键的作用，并且被认为是植物物种形成和适应中的一个重要机制[5]。几乎所有的植物物种都以某种频率产生2n配子，并且2n配子对多倍体源起非常重要[6]。在植物育种中使用2n配子，即有性多倍化，在作物改良方面已经被证实非常有效[7]。2n配子育种不仅可用于创造新的变异，在转移优良目标基因、稳定传递杂合性及保持上位性等方面具备独特的育种优势[8]。三倍体育种作为多倍体育种的一种主要方式， 具有重大的育种价值，例如：叶片变大，变厚，花变大，单株的茎变少，株型变紧凑，对环境压力的抵抗力变强，对疾病的抵抗力变强[9]。利用2n花粉直接与正常配子杂交，可以直接获得三倍体后代，育种周期短。本研究在观察红掌小孢子母细胞减数分裂进程和染色体行为基础上，使用秋水仙素诱导获得了红掌2n花粉，并探讨了2n花粉形成的细胞学机制。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供的红掌品种：大哥大（Dakota），种植于温室大棚（自然光照条件，温度20～30 ℃）。

1.2 方法

1.2.1 倍性分析 倍性分析采用根尖压片法，卡宝品红染色。在 Leica DM2500光学显微镜下镜检，寻找清晰、分散的分裂中期相拍照。

1.2.2 小孢子母细胞减数分裂 小孢子母细胞减数分裂观察采用花药压片法。取肉穗花序，分离出花药，将花药置卡诺固定液中固定24 h以上；取出花药，用滤纸吸除固定液，1 mol/L盐酸60 ℃水浴解离；将花药转移到载玻片上，滴加卡包宝品红染色，压片。在 Leica DM2500 光学显微镜下镜检拍照。

1.2.3 诱导2n花粉 以大多数小孢子母细胞处于前期I时的肉穗花序作为2n花粉的诱导时期。采用棉浸法，肉穗花序被连续处理3 d，含有2% DMSO的0.3%秋水仙素每天上午7：00、下午7：00滴药，至脱脂棉全部浸润。处理完后，对肉穗花序进行清洗，防止残留药液毒害肉穗花序。

1.2.4 n花粉和2n花粉直径的测定 采集新鲜花粉，放置于载玻片，使用醋酸洋红染色。在 Leica DM2500光学显微镜下观察，测量花粉直径，使用SAS软件分析n花粉和2n花粉直径在0.01水平上显著性。

1.2.5 2n花粉形成细胞学特点 当肉穗花序被处理时，每隔2 h，采集肉穗花序，置卡诺固定液中固定24 h以上，卡宝品红染色，压片。在Leica DM2500光学显微镜下，观察小孢子母细胞减数分裂过程中的染色体行为。

2 结果与分析

2.1 ‘Dakota的倍性分析

根据根尖染色压片法，确定‘Dakota红掌是二倍体（2n=2x=30）（图1）。

2.2 減数分裂过程

本研究中发现，‘Dakota小孢子母细胞减数分裂过程的持续时间只有几天，从肉穗花序的底端开始，自下而上，顶端最后。前期I最复杂，前期I分为5个子时期，分别为：细线期（图2-a），偶线期（图2-b），粗线期（图2-c～d），双线期（图2-e），终变期（图2-f）。在终变期（图2）停留很短时间便进入中期I（图2-g～h）。在同一花药中，可以看到从偶线期（图2-b）到末期I（图2-i～j）的所有分裂相，分裂不同步性高，但都能在1 d内完成第一次减数分裂。第2天，采集相近位置的花药，很少观察到第一次减数分裂的图像，观察到的是从前期Ⅱ至末期Ⅱ的图像（图2-k～o），第3天，全部停留在四分体阶段（图4-a）。

2.3 n花粉和2n花粉的直径

采集‘Dakota的正常n花粉（图3-a），测量n花粉直径，计算n花粉体积， 计算样本均值（表1）。采集经秋水仙素处理后的‘Dakota的花粉（图3-b），测量其中大花粉的直径，计算大花粉体积，计算样本均值（表1）。从表1可知：‘Dakota红掌2n花粉直径比n花粉大40%左右，SAS软件分析表明n花粉和2n花粉直径在0.01水平上达到极显著性；2n花粉的体积比n花粉大190%左右，SAS软件分析表明n花粉和2n花粉体积在0.01水平上达极显著性。

2.4 2n花粉遗传细胞学特点

‘Dakota小孢子母细胞经减数分裂后，形成4个单倍体孢子，称作四分体（图4-a）。在被秋水仙素处理的‘Dakota小孢子母细胞经减数分裂后，在正常四分体（图4-a）周围，还观察到了较多的三分体（图4-b）和二分体（图4-c）。为了确定三分体和二分体的形成机制，采集经秋水仙素处理后的肉穗花序，观察减数分裂过程中染色体的异常行为，发现了三极纺锤体（图4-d、e）和融合纺锤体（图4-f、g）。三极纺锤体（图4-d、e）和融合纺锤体（图4-f、g）导致三分体和二分体的形成。此外还观察到4n小孢子母细胞（图4-h），该细胞的染色体数明显大于30条，约60条。也就是说，2n小孢子母细胞被加倍为4n小孢子母细胞，经减数分裂，同样能形成2n花粉。

3 讨论与结论

观察‘Dakota小孢子母细胞减数分裂过程发现，前期I持续时间最长，用时约占减数分裂过程的90%，进一步证明前期I是减数分裂过程中最关键且复杂的一个阶段[4]。本研究发现‘Dakota小孢子母细胞减数分裂进程到达细线末期后，在一个花药中，减数分裂有明显的不同步性，常能同时观察到4～8个不同的减数分裂相，甚至能观察到从偶线期到四分体时期的所有减数分裂相。‘Dakota小孢子母细胞减数分裂的不同步性可以延长花期，增加花粉的有效作用时间，有利于种群繁殖后代[10]。

细胞的尺寸是随着DNA含量的增加而增加的，DNA含量与细胞体积呈正相关[11]。花粉的倍性水平能根据花粉粒的尺寸来判断。2n花粉的直径比n花粉大30%左右，在作物甘薯、芭蕉、玫瑰柿子中已经证实[12-15]，本研究结果发现‘Dakota2n花粉直径比n花粉大40%。‘Dakota的花粉近似球形，所以可以根据测量的直径计算花粉的体积。

2n花粉是减数分裂失调产生的。根据2n花粉形成的遗传机理，把2n花粉分为FDR（first division restitution）型2n花粉和SDR（second division restitution）型2n花粉[11]。FDR型2n花粉，除了重组片段，染色体与体细胞是一致的，具有较高的杂合性，能高效的传递亲本杂合性和上位性，具有很高的育种价值。SDR型2n花粉含有母本一半的染色体，每条染色体都是双份，杂合性较低。减数分裂结束后，三分体和二分体在四分体的周围被发现，表明三分体和二分体与2n花粉的形成有直接关系。1个四分体形成4个n花粉；1个三分体形成1个2n花粉和2个n花粉；1个二分体形成2个2n花粉。本试验通过对诱导过程的小孢子母细胞减数分裂进程观察表明，三极纺锤体和融合纺锤体是发生在第一次减数分裂失败导致细胞学异常现象，这些异常现象是第一次减数分裂复原形成的，而第二次减数分裂正常进行。因此，导致形成的2n花粉是FDR型2n花粉。

参考文献

[1] Sheffer R D， Croat T B. Chromosome numbers in the genus Anthurium（Araceae）Ⅱ[J]. American Journal of Botany， 1983， 70： 858-871.

[2] Mari Marutani， Sheffer R D， Kamemoto H. Cytological analysis of Anthurium andraeanum（Araceae）， Its related taxa and their hybrids[J]. American Journal of Botany， 1993， 80（1）： 93-103.

[3] Wolverton B C， Rebecca C McDonald， Watkins E A Jr. Foliage plants for removing indoor air pollutants from energy-efficient homes[J]. Economic Botany， 1984， 38（2）： 224-228.

[4] Bogdanov Y F. Variation and evolution of meiosis[J]. Russian Journal of Genetics， 2003， 39（4）： 363-381.

[5] Otto SP， Whitton J. Polyploid incidence and evolution[J]. Annual Review of Genetics， 2000， 34： 401-437.

[6] Harlan J， De Wet， J.w.j-On O. Winge and a prayer：the origins of polyploidy[J]. The Botanical Review， 1975， 41（4）：361-390.

[7] Ramanna M S， Jacobsen E. Relevance of sexual polyploidization for crop improvement-a review[J]. Euphytica，2003， 133（1）： 3-18.

[8] 廖瑋玮，邢虎成，揭雨成. 植物2n配子诱导及其应用研究进展[J]. 作物研究， 2011， 25（6）： 599-603.

[9] Younis A， Hwang Y J， Lim K B. Exploitation of induced 2n-gametes for plant breeding[J]. Plant Cell Rep， 2011， 33（2）：215-223.

[10] Wyatt R. Inflorescence architecture： How flower number，arrangement，and phenology affect pollination and fruit-set[J]. American Journal ofBotany， 1982， 69（4）： 585-594.

[11] Bretagnolle F，Thompson J D. Gametes with the somatic chromosome number： mechanisms of their formation and role in the evolution of autoploid plants[J]. New Phytologist， 2005， 129（1）： 1-22.

[12] Becerra Lopez-Lavalle L A， Orjeda G. Occurrence and cytological mechanism of 2n pollen formation in a tetraploid accession of Ipomoea batatas（sweet potato）[J]. Journal of Heredity， 2002， 93（3）： 185-192.

[13] Ortiz R. Occurrence and inheritance of 2n pollen in Musa[J]. Annals of Botany， 1997， 79（4）： 449-453.

[14] Crespel L， Ricci S C，Gudin S. The production of 2n pollen in rose[J]. Euphytica， 2006， 151（2）： 155-164.

[15] Sugiura A， Ohkuma T， Choi Y A， et al. Production of nonaploid（2n=9x）japanese persimmons（Diospyros kaki）by pollination with unreduced（2n=6x） pollen and embryo rescue culture[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science， 2000， 125（5）： 609-614.