洪继旺　陈星星　李松刚　张蕾　杨子琴

摘 要 为阐明H2O2和NO对龙眼成花及FT基因表达的影响，选用9年生‘石硖反季节龙眼，结合H2O2和NO促进剂及信号阻断剂喷施，分析龙眼成花及FT基因表达量的动态变化。结果表明：反季节龙眼FT基因表达量在成花过程中上升，且叶片中FT基因表达高峰时间早于顶芽，而SNP和MV均不同程度上调了FT基因的表达；DMTU和L-NNA有效地抑制了顶芽中FT基因的表达，但对花芽分化后期的叶片中FT基因表达抑制不明显。结合龙眼成花情况，推断H2O2和NO信号在促进龙眼成花方面具有重要作用。

关键词 龙眼；成花；H2O2；NO；FT基因

中图分类号 S667.1 文献标识码 A

Abstract This paper focused on the impact of H2O2 and NO on the expression of FT gene and floral bud formation. We sprayed H2O2/NO generators and signal scavenger to the 9-year-old off-season‘Shixia（a variety of Longan）. The measured parameters includes the cases of floral buds and the dynamic changes of the FT gene expression in the leaves and buds. The results showed that the expression quantity of FT gene of off-season Longan rose up in the process of flowering and the peak period of the expression of the FT gene in leaves was earlier than that in terminal buds. The SNP and MV both increased the expression of FT gene in different degrees. The expression of FT gene in terminal buds inhibited effectively by DMTU and L-NNA，but it was not effectively enough when FT gene expressed in the later period of differentiation of flower buds in leaves. Combined with the formation of flowers in Longan，we believe that H2O2 and NO play an important role in promoting the formation of flowers in Longan.

Key words Longan；Flower bud formation；Hydrogen peroxide（H2O2）；Nitric oxide（NO）；FT gene

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.11.013

龍眼（Dimocarpus longan Loureiro）是典型的亚热带常绿果树，在中国海南、广东、广西、福建等省区广泛种植。龙眼的成花受低温诱导，而强氧化剂氯酸钾可取代低温诱导龙眼反季节成花，这使得经典的花芽分化理论面临新的挑战。氯酸钾的施用势必造成胁迫，氧化胁迫与低温诱导应存在某些共同之处，从而启动了龙眼花芽分化的发生。由此可见，胁迫诱导的生理信号与成花存在一定的相关性。实际上，低温胁迫以及氧化胁迫存在着共同的特征，即都会导致活性氧和活性氮的累积使植物处于胁迫状态[1-2]。

作为比较稳定的一种活性氧信号分子，H2O2调控许多生理过程，包括产生系统抗性、诱导气孔关闭、诱发过敏性反应[3]。Lokhande等[4]发现，拟南芥开花前的抗坏血酸过氧化物酶活性越高，则开花越迟；氧化胁迫越强，开花越早。为此，Lokhande等[4]提出H2O2是诱导开花的一个因子。另有证据表明，H2O2的形成与花发育过程中转录因子的上调表达有关[5]。NO作为信号分子参与了活性氧协同作用，从而启动植物的应逆反应[6]。Zafra等[7]发现，油橄榄成花过程有赖于H2O2和NO的参与，且NO大量爆发时H2O2含量出现下降趋势。低温胁迫可诱导荔枝混合花芽中H2O2和NO含量上升；H2O2和NO发生剂硝普钠和百草枯处理同样可以增加荔枝混合花芽中NO和H2O2含量，促进抽生纯花芽。NO合酶抑制剂L-NNA和H2O2清除剂DMTU抑制荔枝成花，这表明H2O2和NO正调控荔枝成花[8]。关于H2O2和NO在龙眼成花过程中的作用报道较少，H2O2和NO对龙眼成花是否也存在调控作用还有待深入研究。本研究从信号的加强及阻断途径入手，分析H2O2和NO在龙眼成花中对成花及FT基因表达的影响，以期探明龙眼成花的信号分子调节机制。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所选植物材料为9年生的反季节催花‘石硖龙眼，均常规管理。于正造季节摘除龙眼树花序，在新梢抽生3次后进行催花（6月中旬）。催花方式：土施氯酸钾和氯化钾，m氯酸钾 ∶ m氯化钾=6 ∶ 4，每米树冠直径施0.5 kg。

1.2 方法

1.2.1 试验设计与样品采集 试验设信号加强剂、阻断剂及对照共5个处理，即H2O2发生剂百草枯（MV）20 mg/L、 H2O2清除剂二甲基硫脲（DMTU）1 g/L、 NO发生剂硝普钠（SNP）0.1 mmol/L、 NO合酶抑制剂 （L-NNA）0.1 mmol/L、 阴性对照（清水）， 5次重复，每个重复1株树。喷施方式： 对龙眼枝梢进行喷施，喷施至叶片滴水为限， 每处理固定15个枝梢留作观察用。每隔7 d采集样品一次， 直至侧花原基形成前7 d为止， 采集的样品为叶片与顶芽。

1.2.2 RNA提取、反转录与cDNA的PCR扩增 采用天恩泽公司的植物RNAout提取试剂盒及DNA清除试剂盒分别对不同时期的样品进行总RNA的提取及纯化；将得到的RNA进行浓度测定和电泳检测后，取2 μg的RNA进行反转录；将得到的cDNA通过荧光定量PCR方法同时对龙眼成花关键基因和内参基因GAPDH的表达水平进行检测，所采用的引物见表1。

具体反应条件如下：反应总体积为20 μL，其中SYBRR premix Ex TaqTM II（2×）5 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板2 μL，用灭菌DEPC水补足，混合均匀；扩增条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性3 s，60 ℃退火30 s，并收集荧光，40个循环后进行熔解曲线分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对反季节龙眼成花过程中叶片FT基因表达的影响

GAPDH基因和FT基因的PCR扩增分别见图1、图2。氯酸钾反季节催花导致了龙眼叶片中FT基因表达量短暂下降后即出现上升态势，并在催花后14 d上升至最高值，是催花0 d时的2.74倍；随后下降至极低水平（见图3中的CK）。使用SNP处理的龙眼树，在催花后7 d，叶片FT基因表达量变化不大，然而随后上升，催花14 d后，叶片中的FT基因表达量上升至高峰，达到0 d时的6.98倍；使用MV处理时，在催花后7 d，叶片FT基因表达量变化不大，然而随后上升，在催花21 d后FT表达量上升至最高值，达到催花0 d时的7.33倍；DMTU处理显著地抑制了处理初期叶片FT基因表达量，但在21 d时叶片FT基因表达量恢复至催花0 d时的水平；用L-NNA处理7 d后FT基因表达量出现小幅的下调，随后缓慢地上升，至21 d时叶片FT基因表达量上升至0 d时的4.81倍（图3）。

2.2 不同处理对反季节龙眼成花过程中顶芽FT基因表达的影响

除MV处理对氯酸钾反季节催花的龙眼顶芽FT基因表达有较大的影响外，其余各处理与阴性对照有相似的变化趋势。MV处理的顶芽FT基因表达量在催花后7 d上升至峰值，达到0 d时的8.79倍，随后下降至0 d时的6.08～7.36倍之间。而其余各处理与对照的FT基因表达量在催花后有小幅的下降，随后缓慢上升；在催花后21 d，SNP处理的顶芽FT基因表达量达到催花0 d时的4.98倍，DMTU处理的顶芽FT基因表达量达到催花0 d时的3.94倍，L-NNA处理的顶芽FT基因表达量达到催花0 d时的2.42倍（图4）。

2.3 不同药剂处理对反季节龙眼成花的影响

催花后28 d，各药剂处理间表现出很大的差异：SNP（硝普钠，NO发生剂）和MV（百草枯，H2O2发生剂）可显著促进龙眼花芽形成，而L-NNA（NO合酶抑制剂）及DMTU（二甲基硫脲，H2O2清除剂）对龙眼成花有抑制作用（图5）。

3 讨论与结论

在许多植物中，FT基因及其同源物被认为是强大的开花推动者，在调节从营养生长阶段到生殖生长阶段的过渡中起着至关重要的作用[9-11]。拟南芥接受合适的光周期诱导后，FT的转录本（mRNA）从叶片移动到顶端组织，翻译后的FT蛋白促进了下游成花基因AP1的表达，进而促进开花[12]，且过量表达FT基因，拟南芥花期明显提前[13]。有相关学者提出FT可能就是通常说的开花素（florigen）。酵母双杂交试验发现，在苹果中FT同源基因编码蛋白、TCP（teosinte branched1， cycloidea and proliferating cell factors）基因以及VOZ1（vascullar plant one zinc finger protein）基因编码蛋白相互作用，不仅参与了分生组织细胞增殖，而且影响叶片和果实的发育[14]。本研究中也发现，反季节催花（氯酸钾处理）的龙眼，FT基因在成花过程中表达量上升，且叶片中FT基因表达高峰时间早于顶芽。而SNP和MV均不同程度上调了FT基因的表达；DMTU和L-NNA有效地抑制了顶芽中FT基因的表达，对花芽分化后期叶片中的FT基因表达抑制不明显。

在植物与环境的互作中，适当的胁迫往往促进开花，如高温胁迫可诱导水仙花FT-like NFT1基因高量表达[15]；干旱胁迫造成了拟南芥中包括FT基因在内的4 153个成花相关基因差异表达[16]。而氯酸钾处理代替低温胁迫诱导龙眼成花也是胁迫后产生的生理效应，由FT基因的表达丰度变化的时序，推测龙眼感受胁迫的部位首先是叶片，成花基因的表达最早在叶片中上调，然后才是顶芽的FT基因表达上调，这与Ream等[17]在二穗短柄草的研究结论相同，即低温可诱導短柄草FT基因表达量上调，且叶片是低温胁迫的最先感知部位，成花基因的最早表达也出现在叶片中，随后才是树体其他部位一系列的变化。

综上所述，结合龙眼成花情况，推断H2O2和NO在促进龙眼成花方面具有重要作用。

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