赵静，刘婷，蔡柏岩，刘鹏，钱镭，*

（1.黑龙江东方学院食品与环境工程学部，黑龙江哈尔滨150066；2.国家乳业工程技术研究中心，黑龙江哈尔滨150086）

HPLC法测定原料乳中庆大霉素残留的研究

赵静1，2，刘婷1，蔡柏岩1，刘鹏2，钱镭1，*

（1.黑龙江东方学院食品与环境工程学部，黑龙江哈尔滨150066；2.国家乳业工程技术研究中心，黑龙江哈尔滨150086）

建立测定原料奶中庆大霉素C组分的高效液相色谱法。通过加入适量沉淀剂除去样品中大部分蛋白质，采用邻苯二甲醛试剂柱前衍生化，利用C18色谱柱，以含有0.02 mol/L的甲醇-醋酸溶液为流动相进行梯度洗脱，用荧光检测器检测，激发波长340 nm、发射波长450 nm。结果表明，回收率在85.6%～97.3%，精密度（RSD）为1.21%～4.04%，最低检出限为0.2 μg/mL。该方法可用于原料奶中庆大霉素残留4种组分的测定。

高效液相色谱；庆大霉素；邻苯二甲醛；柱前衍生

近年来，庆大霉素因其价格低廉易得而被广泛的应用于治疗动物的消化道和呼吸道疾病［1］，因此庆大霉素在动物体内的残留情况也越来越受到人们的广泛关注。中国农业部对动物性食品中庆大霉素的最高残留限量有明确的规定［2］，出台了相应的检测标准［3］，但方法的重复性较差，灵敏度较低，检测时间较长，仅能检测庆大霉素的一种成分，然而庆大霉素主要含C1、C1a、C2、C2a 4种有效组分（C组分），各组分的抗菌活性及毒性不同，其含量比例以及纯度在各国药典中都有明确规定［4］。为了方便乳及乳制品中抗生素残留的日常监测，需要建立能够同时测定庆大霉素4个组分的快速简单的检测方法。

本方法通过沉淀样品中的蛋白质和脂肪等干扰物质，采用邻苯二醛试剂柱前衍生化，用离子对反相色谱法进行分离测定。考察了流动相配比、波长控制、衍生时间和温度等衍生条件的控制，建立了梯度洗脱高效液相色谱法用于原料奶中庆大霉素残留的检测，11 min内即可使庆大霉素C组分与相邻各峰获得良好分离，适于用于检测机构以及企业的快速检验，并为庆大霉素产品的质量控制及其质量标准的改进提供了新的有效手段，其灵敏度高，重现性好。

1材料与方法

1.1 仪器设备

Waters2695高效液相色谱仪，包括四元泵、自动进样器、Empower色谱工作站，配Waters2475荧光检测器：美国Waters公司；QL-901型振荡器：江苏海门市麒麟医用仪器厂；Oasis MCX（mixed-modecation exchange）固相萃取柱：美国Waters公司；电子天平；离心机；氮吹仪；水浴锅；酸度计等。

1.2 材料试剂

庆大霉素标物质（≥99%）：国家标准物质研究中心；甲醇（色谱纯），天津科密欧公司；正己烷；庚烷磺酸钠；氢氧化钾；硼酸；磷酸氢二钠；三氯乙酸；异丙醇；邻苯二甲醛；实验用水均为三级水；

庆大霉素标准溶液：准确称取庆大霉素标准品0.050 mg，甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，摇匀，配成1.000 mg/mL标准贮备溶液，使用时按需要制成相应的标准工作液。

0.02 mol/L庚烷磺酸钠溶液：称取庚烷磺酸钠0.809 g，用双蒸水定容至100 mL。

硼酸缓冲液：称取硼酸2.47 g，溶于90 mL水中，用45%KOH溶液调pH至10.4，加水定容至100 mL。

磷酸盐缓冲液：称取Na2HPO41.412 g，加水溶解并稀释至100 mL。

5%三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸2.5 g，加磷酸盐缓冲液溶解并定容至50 mL。

邻苯二甲醛衍生剂：称取邻苯二甲醛0.2 g，用1 mL甲醇和19 mL硼酸缓冲液溶解，加入0.2 mL 2-巯基乙醇，用KOH调节pH至10.4，现用现配。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil-C18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温：30℃；检测器：荧光检测器：激发波长340 nm、发射波长450 nm；流动相：含有0.02 mol/L庚烷磺酸钠溶液的甲醇-醋酸（200∶5体积比）溶液；流速1.0 mL/min；进样量：10 μL。

1.3.2 样品处理

1.3.2.1 提取

称取室温解冻的牛奶样品5 mL置于50 mL离心管中，加入2 mL的5%三氯乙酸溶液，于旋涡混合器上混匀2 min，以6 000 r/min离心10 min。分出上清液，沉淀再加入2 mL 5%三氯乙酸溶液，重复上述操作一次，合并上清液，加入2 mL正己烷脱脂，于旋涡混合器上混匀，静止1 min，以6 000 r/min离心10 min，弃去正己烷层，加入2 mL 0.05 mol/L的庚烷磺酸钠溶液，混匀后供固相萃取柱净化。

1.3.2.2 净化

依次用甲醇、水和庚烷磺酸钠缓冲液各3 mL活化固相萃取柱，取上述样品上样，待样品全部流出后，分别用2 mL 0.02 mol/L庚烷磺酸钠溶液和2 mL水淋洗，弃去全部流出液，固相萃取柱真空抽干1 min。最后用体积比为55∶45的乙腈-0.02 mol/L庚烷磺酸钠溶液2 mL洗脱，收集洗脱液于指形瓶中。

1.3.2.3 浓缩与富集

将净化时收集的洗脱液在60℃下用氮吹仪浓缩至近干，用甲醇-水（6∶4，体积比）2 mL溶液溶解残渣。

1.3.2.4 柱前衍生化

浓缩后的样品加入2 mL异丙醇后加入1 mL的邻苯二甲醛（OPA）衍生剂混匀，50℃水浴20 min后，冷却至室温，取10 μL样品过膜后，供高效液相色谱测定。

1.3.3 标准曲线的制备

将庆大霉素标准储备液，依次稀释为5、25、50、75、100、200、500 μg/mL的标准工作液，柱前衍生化处理后，取10 uL进样，每个标准溶液重复进样3次，以标准溶液浓度水平为横坐标，以待测物色谱图的平均峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4 方法的专属性

分别取3组空白奶样，按样品处理方法项下操作，进样10 μL，获得空白样品的色谱图，将一定浓度的标准工作液加入空白基质中，依同法操作，获得相应的色谱图，将一定浓度的标准工作液依同法操作，获得相应的色谱图。

1.3.5 精密度和准确度的测定

分别在同一天和连续5 d制备浓度为25、100、500 μg/mL的庆大霉素原料奶样品，每个浓度设5个重复，根据日内与日间变异系数评价方法的精密度和准确度。

1.3.6 回收率

配制标准浓度分别为25、100、500 μg/mL的庆大霉素原料奶样品，每一浓度进行5个样本分析，取10 μL进样分析，获得相应的峰面积，以每一浓度处理的样品与理论添加标准品量的比值计算方法回收率。

1.3.7 灵敏度

向空白奶样中添加不同浓度的相应标准品溶液，以信噪比S/N=3时的最低浓度为最低定性检测限，S/ N=10时的最低浓度为最低定量检测限。

2结果与分析

2.1 色谱条件的确定

用于庆大霉素检测是色谱柱主要有C18和C8 2种，本实验中选择C18柱，由于庆大霉素具有极性和离子特征，它通常在反相色谱柱上不易分离，因此在本实验流动相中加入了醋酸缓冲液，以改善庆大各组分在C18柱上的分配性能［5-6］。

农业部1163号公告-7-2009采用了梯度洗脱的方式进行测定庆大霉素，结果只能检测庆大霉素一种成分［3］。朱立勒等采用了甲醇：0.01 mg/L的醋酸铵缓冲液pH=7为流动相，以威替米星为内标物建立了硫酸庆大霉素血清样品的高效液相色谱检测法，该方法中虽然硫酸庆大霉素的C1a，C2，C2a三组分被较好的分离出来，但其最低检测限较高［7］。王春艳等以甲醇-0.02 mol/L庚烷磺酸钠溶液为流动相，较好地分离了庆大霉素的4个成分，但是检测限较高［8］。本实验以含有0.02 mol/L庚烷磺酸钠溶液的甲醇-醋酸（200∶5体积比）溶液为流动相，不仅可以检测出庆大霉素4种成分，而且检测限较低。

2.2 庆大霉素标准曲线的制备

将庆大霉素储备液稀释以后，进行检测得出了庆大霉素的标准曲线，结果如图1，在庆大霉素浓度为5 μg/mL～500 μg/mL期间，标准曲线线性良好，相关系数为0.999 3。

图1 庆大霉素标准曲线Fig.1Standard Curve of Gentamicin

2.3 方法专属性

图2是庆大霉素标准工作液色谱图。

图2 庆大霉素标准工作液色谱图Fig.2Chromatogram of Gentamicin Working Solution

从图2中我们可以清楚看到庆大霉素4个组分（C1、C1a、C2、C2a）得到很好地分离，并且图形尖锐，4个组分的保留时间分别为2.828、9.086、9.536、9.718 min。图3、图4分别是空白奶样色谱图和空白奶样加庆大霉素标准品色谱图。

由图3和图4可以看出，庆大霉素的4个组分分离良好，奶样中的内源性物质对样品无干扰，本实验以C1的含量为标准来确定庆大霉素的含量。

图3 空白奶样色谱图Fig.3Chromatogram of Blank Sample

图4 空白奶样加庆大霉素标准品色谱图Fig.4Chromatogram of Blank Milk Sample with Gentamicin standard sample

2.4 精密度和准确度的测定

精密度和准确度的测定见表1。

表1 庆大霉素在牛奶中的精密度和准确度Table 1Precision and Accuracy of Gentamicin

由表1可知，在牛奶中庆大霉素高、中、低浓度的日内精度均小于5%，日间精度均小于5%。

2.5 方法回收率

在牛奶中添加庆大霉素，所测的回收率数据见表2。

表2 牛奶中庆大霉素的方法回收率Table 2Recovery Rate of Gentamicin

从表2中可以看出该方法在庆大霉素浓度为25、100μg/mL和500μg/mL时平均回收率为86.3%、87.5%和91.4%，总回收率为88.72%，回收率均符合测定要求。

2.6灵敏度测定

根据信噪比（S/N）的值来确定最低定性检测限和最低定量检测限，结果表明该方法最低定性检出限为0.1 μg/mL，定量检出限为0.2 μg/mL。

3结论

本实验以含有0.02 mol/L的甲醇-醋酸溶液为流动相，采用邻苯二甲醛试剂柱前衍生，利用C18色谱柱进行分离检测，可以较好地检测出庆大霉素4个组分C1、C1a、C2、C2a。通过该方法可以较快地将庆大霉素检测出来，同时4个组分峰形良好，该方法灵敏度较高，最低定量检测限为0.2 μg/mL，定性检测限为0.1 μg/mL，通过该方法的建立缩短了乳中庆大霉素检测时间，同时又可以快速检测庆大霉素的4个组分，所以该方法更适合乳中庆大霉素的检测。

［1］王丹，许杨，何庆华，等.Elispot assay检测牛奶中庆大霉素［J］.食品与生物技术学报，2011，30（2）：224-227

［2］陈一资，胡滨.动物性食品中兽药残留的危害及其原因分析［J］.食品与生物技术学报，2009，28（2）：162-166

［3］中华人民共和国农业部农业部1163号公告动物性食品中庆大霉素残留检测高效液相色谱法［S］.北京：中国标准出版社，2009

［4］刘承伟，罗志辉，陆尉天，等.HPLC-共振瑞利散射联用测定庆大霉素各组分［J］.广西师范大学学报：自然科学版，2010（3）：37-41

［5］侯亚莉，朱奎，郭平，等.高效液相色谱法测定牛肌肉中庆大霉素残留的研究［J］.中国农学通报，2008，24（6）：102-106

［6］侯亚莉，苏亮，丁平，等.庆大霉素的残留检测方法［J］.中国饲料，2007，12（1）：1-3

［7］朱立勤.氨基糖苷类抗生素时辰给药方案的实验研究［D］.天津医科大学，2005

［8］王春艳，李艳华，张秀英.检测猪血浆中林可霉素和庆大霉素浓度的HPLC方法的建立［J］.东北农业大学学报，2011，42（12）：39-44

Determination of Gentamicin in Raw Milk by High-performance Liquid Chromatopraphy

ZHAO Jing1，2，LIU Ting1，CAI Bai-yan1，LIU Peng2，QIAN Lei1，*
（1.Food and Environmental Engineering Department，Heilongjiang East College，Harbin 150066，Heilongjiang，China；2.National Research Center of Dairy Engineering and Technology，Harbin 150086，Heilongjiang，China）

To establish a HPLC method for determination of gentamicin in the raw milk.Protein in milk were mostly eliminated by the precipitators，OPA was used for derivatization，and then separated on C18 column witha mixed solution of methanol-acetic acid as mobile phase，and excitation and emission wavelength are 340 nm and 450 nm with a fluorescence detector The recovery were 85.6%-97.3%，the relative standard deviations（RSD）were 1.21%-4.04%，the minimum detectable values were 0.2 μg/mL.This method can be used for the routine analysis of gentamicin in raw milk.

high-performance liquid chromatopraphy；gentamicin；OPA；precolumn derivatization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.09.026

2013-11-18

黑龙江省高等学校青年学术骨干支持计划（项目编号：1253G048）

赵静（1988—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：乳品质量与安全。

*通信作者：钱镭（1981—），男（汉），副教授，硕士生导师，博士。