李榕，孙杰，余恒琳

（南京市产品质量监督检验院，江苏南京210019）

西式发酵香肠中生物胺含量的调查分析

李榕，孙杰，余恒琳

（南京市产品质量监督检验院，江苏南京210019）

综述生物胺的种类、危害及在西式发酵香肠中存在的可能，采集了西式发酵香肠的样本，检测了其5种生物胺（尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺）及4种微生物（乳酸菌、微球菌、肠细菌、假单胞菌）的含量。经分析得出结论：5种生物胺在西式发酵香肠中普遍存在；肠细菌的数量与生物胺的含量有显著的相关性，未发现其他3种微生物与生物胺含量之间的关系。

西式发酵香肠；生物胺；调查；分析

生物胺（biogenic amines，BA）是一类含氮的脂肪族、芳香族或杂环类低分子化合物，食品中的生物胺主要由微生物产生的脱羧酶催化氨基酸脱羧而产生［1］。适量的生物胺有助于人体正常的生理功能，过量则会引起不良的生理反应，可导致血压升高，头痛，脸色潮红，出现皮疹。还会导致胃肠功能紊乱，包括突然出现呕吐和腹泻，并伴随腹痛等症状［2］。因此对生物胺进行研究可以提高和改善食品的质量及安全性。

发酵肉制品是世界上公认的生物胺重要来源［3］。国外对发酵肉制品中的生物胺已做了大量的调查，认为生物胺在发酵香肠中普遍存在，只是不同的发酵肉中存在的种类和数量不同［4］。发酵肉制品中生物胺的产生和累积相当复杂，受原料肉的特性、微生物的种类和数量、生产工艺及贮藏条件、添加剂等影响［5］。本研究从西式发酵香肠（如萨拉米）入手，通过采集样品，检测并分析其5种生物胺（尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺）及4种微生物（乳酸菌、微球菌、肠细菌、假单胞菌）的含量，论证西式发酵香肠中微生物与生物胺之间的关系。

1材料与方法

1.1 试验材料

市购西式发酵香肠共13批样品：A组（比萨香肠2批、巴玛香肠1批），B组（金字香肠2批、萨拉米香肠3批、），C组（帕尔马香肠1批、萨拉米香肠1批），D组（巴玛香肠2批）、E组（黑森林香肠1批）。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂及培养基

生物胺标准品：尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺和丹磺酰氯Merck公司；

乙腈和丙酮为色谱纯Merck公司；硝酸银、高锰酸钾、草酸钠、乙酸锌、硫氰酸钾、亚铁氰化钾、氨水、高氯酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、D-甘露醇、氯化钠、酚红等为分析纯，购自国药集团化学试剂北京有限公司；自制超纯水（明澈-D 24UV，Millipore公司）；MRSA培养琼脂，VRBDA培养基，假单胞分离琼脂，泰普生物科技（中国）有限公司；牛肉膏、蛋白胨、MSA琼脂等购自北京拜尔迪生物技术有限公司

1.2.2 主要仪器设备

DELTA-320型pH计：梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；F6/10型超细匀浆机：上海弗鲁克流体机械；GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；ESCO-A2型生物安全柜：惠诺德（北京）科技有限公司；SX-700型高压灭菌锅：日本TOMY公司；SPX-150B生化培养箱：上海跃进医疗器械厂；1810D型实验室超纯水系统：上海摩勒生物科技有限公司；Agilent1200型DAD高效液相色谱仪：安捷伦公司；HHS-28S型数显恒温水浴锅：上海精风仪器有限公司；PL202-L型电子天平：梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；L303-2型电热恒温培养箱：沪申通试验电器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 细菌计数

取20 g香肠，加入到180 mL已灭菌的蛋白胨生理盐水中，在200 r/min、室温下摇10 min，取1 mL再用生理盐水逐级稀释到适当浓度。乳酸菌用MRS培养基，在30℃条件下培养72 h；微球菌用MSA培养基，30℃培养48 h；肠细菌用VRBGA培养基，30℃培养48 h；假单胞菌用假单胞菌分离培养基，25℃培养72 h。

1.3.2 生物胺的检测方法

检测方法在GB/T5009.208-2008《食品中生物胺含量的测定》［6］的基础上，进行了条件的优化［7］。图1为生物胺标准品的色谱图。

图1 生物胺标准品色谱图Fig.1HPLC chromatograms of biogenic amine standard solutions

1.3.2.1 色谱条件

色谱柱为C-18反相柱，4.6×150 mm2，粒径5 μm，为了获得较好的分离效果，选择不同的流动相并结合梯度洗脱对样品进行分离，紫外检测波长为254 nm，进样量20 μL。

1.3.2.2 标准曲线的绘制

准确称取酪胺、尸胺、组胺、精胺、亚精胺各50 mg，用0.4 mol/L的高氯酸（HClO4）定容至50 mL，制成储备液备用。

分别取以上标准品储备液，用0.4 mol/L HClO4配制成终浓度分别为1.0、2.5、5.0、10、20、50、75 μg/mL的混合标准溶液。然后进行衍生处理、分析，以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标曲线，5种生物胺的峰面积与其相应浓度分别呈良好的线性关系，其中尸胺的相关系数为0.999 9，其它生物胺的相关系数也都大于0.99，生物胺的浓度在1 μg/mL～75 μg/mL的范围内是线性相关的。

1.3.2.3 样品的衍生

1 mL的生物胺标准品混合溶液，加入200 μL的2NNaOH使之呈碱性，然后再加入300 μL的饱和NaHCO3溶液缓冲，再加入1 mL的丹磺酰氯溶液（10 mg/mL丙酮），在黑暗中置于40℃的水浴中，30 min后取出，加入100 μL的氨水中断反应，并去除多余的丹磺酰氯。最后用乙腈调整到5 mL。将其用0.45 μm的有机滤膜过滤后用于检测。

1.3.2.4 样品溶液的制备

取5 mL或5 g的待测样品（乳酸菌发酵液），加入20 mL 0.4 mol/L HClO4溶液，均质后2 500 r/min离心5 min。沉淀部分再用上述步骤抽提，两次的上清液合并在一起，再用0.4 mol/L HClO4定容至50 mL。取1 mL的酸提取液按1.3.2.3中的方法衍生。

1.3.2.5 检测限

以信噪比（S/N）大于3作为判断标准。尸胺、亚精胺、组胺的检测限为0.05 μg/mL，酪胺的检测限为0.1 μg/mL，精胺的检测限为0.25 μg/mL。

1.3.2.6 精密度及衍生物稳定性试验

为确定方法的精密度，分别以3种浓度的标准溶液（2.5、10、50 μg/mL）进行测试，5种生物胺在高、中、低3种浓度下，精密度良好。

为确定衍生物的稳定性，以5种生物胺的丹磺酰氯衍生物溶液在选定的色谱条件下，在3天内分别进行测定，发现峰面积变化不大，丹磺酰氯衍生物比较稳定。但为了保证结果的准确性，最好是样品处理好之后立即测定。

2结果与分析

2.1 生物胺含量调查

调查的13批西式发酵香肠中5种生物胺含量如表1所示。

通过对不同样品生物胺总量聚类分析，可将这13种西式发酵香肠分为4组。第一组是生物胺低含量的香肠即A组，总量为（0.01～200mg/kg）；第二组是生物胺中等含量的香肠即B组，总量为（200～400 mg/kg）；第三组是生物胺较高含量的香肠即C组，总量为（400 mg/kg～600 mg/kg）；第四组是生物胺高含量的香肠即D组，总量为（600 mg/kg～1 000 mg/kg）；第五组是生物胺超高含量的香肠即E组，总量为大于1 000 mg/kg。FDA规定食品中生物胺总量不得超过1 000 mg/kg。从检测结果分析，13批西式发酵香肠中均检出5种生物胺，可见五种生物胺在西式发酵香肠中普遍存在。2.2微生物对生物胺含量的影响

表1 发酵香肠中生物胺含量调查结果（mg/kg，n=6）Table 1Investigation results of biogenic amines content in west style fermented sausage（mg/kg，n=6）

发酵香肠中产生的氨基酸脱羧酶微生物主要有假单胞菌、肠细菌、微球菌和乳酸菌［1］。本研究样品中各种微生物数量见表2。

在所有样品中均未检测到假单胞菌，这可能由于假单胞菌细胞壁较薄，在成熟后期香肠的水份活度变低，食盐含量相对有所增加，致使其失活。肠细菌的数量从1.70 log cfu/g到4.52 log cfu/g，其数量与生物胺含量显著相关（r=0.7286）。乳酸菌和微球菌，是传统中式香肠中优势菌，数量分别是从3.53 log cfu/g到7.78 log cfu/g和从2.70 log cfu/g到6.12log cfu/g。从检测数据分析，本研究中没有发现乳酸菌和微球菌与生物胺含量之间的必然联系。

表2 发酵香肠微生物特性调查结果（n=6）Table 2Investigation results of microbial charateristics in west style fermented sausage（n=6）

3讨论

由于目前我国西式发酵香肠的生产企业较少，国内有2家大型企业生产的西式发酵香肠市场占有率较高。因此本研究的样品均来自这两个生产企业，检测的重点指标是生物胺含量和微生物指标，目的是从原料的原始菌相着手，从宏观上找出微生物菌种与西式发酵香肠中相关联系。

从检测结果分析，样本中均检出五种生物胺，肠细菌的数量与生物胺含量有显著的相关性（r=0.728 6），这可能与肠细菌产生氨基酸脱羧酶能力强有关［8］。与Latorre-Moratalla等观点基本一致［9］，未发现乳酸菌、微球菌和假单胞菌与生物胺含量之间的关系。

［1］李平兰，沈清武.干发酵香肠中生物胺的产生与控制［J］.食品与发酵工业，2004，30（11）：59-64

［2］冯婷婷，方芳，杨娟，等.食品生物制造过程中生物胺的形成与消除［J］.食品科学，2013，34（19）：360-366

［3］张春江，杨君娜，王芳芳，等.肉制品中生物胺产生与控制研究进展［J］.中国食物与营养，2010，7：17-20

［4］李志军，吴永宁，薛长湖.生物胺与食品安全［J］.食品与发酵工业，2004，30（10）：84-91

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［6］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/ T5009.208-2008《食品中生物胺含量的测定》［S］.中国标准出版社.2008：1-4

［7］卢士玲，徐幸莲，舒蕊华，等.传统中式香肠中生物胺调查研究［J］.食品与发酵工业，2009，35（10）：141-146

［8］通力嘎，靳志敏，段艳，等.发酵香肠中生物胺含量影响因素的研究进展［J］.肉类研究，2012，26（4）：36-39

［9］LATORRE-MORATALLA ML，BOVER-CID S，TALON R，et al. Strategies to reduce biogenic amine accumulation in traditional sausage manufacturing［J］.LWT-Food Science and Technology，2010，43（1）：20-25

Investigation and Analyse the Content of Biogenic Amines in Western Style Fermented Sausage

LI Rong，SUN Jie，YU Heng-lin
（Product Quality Supervision and Inspection Institute of Nanjing，Nanjing 210019，Jiangsu，China）

Summarize the biogenic amines species，toxicity，the presence of these compounds in western style fermented sausage.This paper collecting the western style fermented sausage samples，detecting five species of biogenic amines（Cadaverine，Histamine，Tyramine，Spermidine，Spermine）and four kinds of microbes（Lactobacillus、Micrococcu、Enteric bacteria、Pseudomonadaceae）.Analysis the following conclusions：the five species of biogenic amines are widespread in western style fermented sausage；there were a significant correlation between the auantity of Enteric bacteria and the content of biogenic amines；no relationship was found between the the content of biogenic amines and the other microbes.

western style fermented sausage；biogenic amines；investigation；analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.09.025

2014-10-26

国家科技支撑计划（2011BAK21B00）南京青奥会支撑技术集成应用与示范

李榕（1971—），女（汉），硕士，高级工程师，主要研究方向：食品安全与检测。