胡小明*， 彭勤龙

(平顶山学院化学化工学院，河南平顶山 467000)

琥乙红霉素(EES)是红霉素的琥珀酸乙酯，其化学结构及药理作用均与红霉素相似，通过在体内水解释放出红霉素而起抗菌作用，属于大环内酯类抗生素，主要用于对青霉素耐药的葡萄球菌感染，对革兰氏阳性杆菌、部分革兰氏阴性杆菌以及梅毒螺旋体也有较强的抑制作用，具有抗菌谱广、吸收好的特点。

目前，检测琥乙红霉素的方法主要有微生物检定法[1]、高效液相色谱法[2,3]、光度法[4 - 6]、毛细管电泳法[7 - 9]以及流动注射电化学发光法[10,11]等。本文利用琥乙红霉素与甲基红(MR)发生荷移反应的原理，建立了一种快速、简便测定药物制剂中琥乙红霉素含量的分光光度法。该方法设备简单，操作方便，结果准确，适用于药物制剂中琥乙红霉素含量的快速测定。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

UV-2550双光束紫外-可见分光光度计(日本,岛津分光公司)；723S型可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(河南予华仪器有限公司)。

琥乙红霉素标准溶液：准确称取0.0500 g琥乙红霉素标准品(EES,山东西亚化学工业有限公司)，加适量无水乙醇全部溶解后，转移入100 mL容量瓶中，摇匀定容，浓度0.5 mg/mL;甲基红(MR，国药集团化学试剂有限公司)乙醇溶液：1.0×10-3mol/L。实验所用试剂皆为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

琥乙红霉素片剂(西安利君制药有限责任公司，批号：1305198)；琥乙红霉素颗粒(希百寿药业有限公司，批号：20131002)。

1.2 实验方法

移取适量琥乙红霉素标准工作溶液于25 mL容量瓶中，加入甲基红溶液1.5 mL，用乙醇-水混合溶剂稀释至刻度，摇匀，于室温下反应20 min后，以试剂空白为参比，用1 cm比色皿，在UV-2500双光速紫外-可见分光光度计上，于波长421 nm处测定络合物的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 吸收光谱

图1 MR和MR-EES的吸收光谱Fig.1 Absorption spectra of MR and MR-EES complex 1.MR(6.0×10-5 mol/L) reagent against ethanol;2.MR(6.0×10-5 mol/L)-EES(60.0 μg/mL) complex against the reagent blank.

按实验方法，用UV-2550双光束紫外-可见分光光度计在350～650 nm范围内进行光谱扫描，绘制吸收光谱，见图1。琥乙红霉素在波长350～650 nm范围内没有吸收，甲基红的最大吸收波长为516 nm，加入琥乙红霉素后(以乙醇-水为溶剂，室温下反应20 min)，在516 nm处的吸光度降低，吸收峰消失，在421 nm处出现一个新的最大吸收峰，最大吸收波长紫移95 nm，说明甲基红和琥乙红霉素发生了电荷转移反应并生成一种新物质。本实验选取421 nm作为测定波长。

2.2 实验条件的优化

2.2.1溶剂的选择按实验方法，选用二次蒸馏水、甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇、正丁醇、正丙醇、丙酮作反应溶剂，考察不同溶剂对体系吸光度的影响。实验发现，二次蒸馏水作溶剂时，吸光度最大，灵敏度最高。考虑到琥乙红霉素和甲基红溶液均由无水乙醇配制，改变乙醇与水的比例为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶8，考察溶剂中乙醇与水的比例对体系吸光度的影响。实验表明，当乙醇∶水为1∶4时，吸光度最大。向体系中加入酸、碱或缓冲溶液时，均会降低反应体系的灵敏度。实验确定反应溶剂为1∶4的乙醇-水混合溶液。

2.2.2反应时间与温度的影响按照实验方法，改变反应时间为5、10、15、20、25、30、35 min，考察反应时间对体系吸光度的影响。当反应时间为20 min时体系吸光度最大，8 h内吸光度基本保持不变。确定反应时间为20 min。

按照实验方法，改变反应温度为15、20、25、30、35、40 ℃，考察反应温度对体系吸光度的影响。结果表明，当反应温度为25 ℃时，体系吸光度最大，温度进一步升高，体系的吸光度下降，可能由于反应温度升高，造成荷移络合物的稳定性降低。实验确定反应在室温下进行。

2.2.3试剂用量的影响按照实验方法，改变甲基红的用量为0.5、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5 mL，考察甲基红用量对体系吸光度的影响。结果表明，甲基红用量为1.5 mL时，体系吸光度最大且稳定。实验确定甲基红用量为1.5 mL。

2.2.4表面活性剂的影响实验选用聚乙二醇、十六烷基三甲基氯化铵、十二烷基苯磺酸钠、吐温80、OP-10作为表面活性剂，考察表面活性剂对体系吸光度的影响。结果表明，表面活性剂对反应体系没有明显的增敏作用。确定实验不选用表面活性剂。

2.3 工作曲线

在最佳条件下，对琥乙红霉素的系列标准溶液进行测定，绘制工作曲线。结果表明，琥乙红霉素浓度在2.0～84.0 μg/mL范围内与吸光度呈现良好的线性关系，线性回归方程为：A=0.0169c(μg/mL)-0.0124，线性相关系数r=0.9991，表观摩尔吸光系数ε为1.48×104L·mol-1·cm-1。

2.4 检出限及精密度的测定

按实验方法平行测定试剂空白溶液11次，计算标准偏差，按3倍的标准偏差计算出本方法的检出限为1.06 μg/mL。按实验方法平行配制6份琥乙红霉素含量为20 μg/mL的反应体系，测定其吸光度，得其相对标准偏差(RSD)为1.27%。

2.5 络合物的组成及稳定常数

应用等摩尔连续变化法和摩尔比法测定荷移络合物的组成比。结果得到络合物的组成为1∶1，稳定常数为1.445×105。

琥乙红霉素属于大环内酯类抗生素,是一种富电子物质，可以作为电子供给体；甲基红分子结构中苯环上连有一个吸电子的羧基和一个偶氮基团，使苯环上的电子云密度降低，从而具有一定的接受电子的能力，属于缺电子物质，与作为供电子体的琥乙红霉素发生络合反应，两者在溶液中可以形成稳定的n-π型荷移络合物。基于荷移络合物的组成可推测荷移反应表示如图2。

图2 荷移络合物的形成过程Fig.2 Forming process of charge-transfer complex

2.6 干扰离子的测定

2.7 样品分析

取琥乙红霉素片剂2片(标示量为125 mg/tablet，批号:1305198)和琥乙红霉素颗粒2袋(标示量为100 mg/bag,批号：20131002)内容物，研碎，准确称取相当于原药50 mg的量，用无水乙醇全部溶解后，过滤，取其滤液，定容于100 mL容量瓶中。取此两种溶液各1 mL，按照实验方法，分别测定反应体系的吸光度，根据线性回归方程计算出两种药物中琥乙红霉素的含量。同时用标准加入法进行回收实验，结果如表1所示。

表1 样品中琥乙红霉素的测定结果(n=5)Table 1 Determination results of erythromycin ethylsuccinate in samples(n=5)

3 结论

本文利用琥乙红霉素与甲基红的荷移反应,建立了测定药物制剂中琥乙红霉素含量的荷移光度法。该方法简便、快捷，重现性较好，回收率高。测定样品中琥乙红霉素含量，结果良好。