加压毛细管电色谱分离检测中药厚朴中和厚朴酚与厚朴酚

2015-10-16李利军张瑞瑞

分析科学学报 2015年5期

胡延，李利军*，张瑞瑞

(广西科技大学生物与化学工程学院,广西柳州 545006)

图1 厚朴酚与和厚朴酚的分子结构式 Fig.1 The molecular formula of magnolol and honokiol

厚朴，别名紫朴、紫油朴、温朴等，为木兰科、木兰属植物厚朴或凹叶厚朴的干燥干皮、根皮及枝皮，是我国重要的传统中药。厚朴味苦、辛，性温。归脾、胃、肺、大肠经。主治燥湿消痰，下气除满。用于湿滞伤中，脘痞吐泻，食积气滞，腹胀便秘，痰饮喘咳等[1]。其主要成分为和厚朴酚、厚朴酚，结构式如图1。根据其药理研究[2]，厚朴具有抗病毒、抗肿瘤、抗细菌的作用，且抗菌性质稳定，不易受热、酸、碱的影响，还具有明显的抗炎、镇痛，抗溃疡，抗氧化的作用。此外，厚朴中的有效成分对中枢神经也有一定的作用。

目前，中药材厚朴中和厚朴酚、厚朴酚的分离分析方法主要有毛细管区带电泳法[3]、气相色谱法[4]、高效液相色谱法等[5,6]。毛细管电色谱(CEC)不仅兼具毛细管电泳(CE)和高效液相色谱(HPLC)的优点[7]，而且克服了CE选择性差和分离中性物质困难的缺陷，同时又避免了HPLC需消耗大量溶剂的缺点。加压毛细管电色谱(pCEC)是在施加电压的同时，通过微型液相色谱泵附加一定压力驱动流动相，优点是既避免了分离过程中产生气泡，提高稳定性，又可用压力来控制流速，缩短分离时间，并能实现CEC的梯度洗脱[8 - 12]。本实验采用反相加压毛细管电色谱结合紫外检测技术，建立了厚朴酚、和厚朴酚的快速分离分析方法。该方法样品预处理简单，可用于中药材厚朴中和厚朴酚、厚朴酚的同时分离检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

TriSepTM-2100加压毛细管电色谱仪(Unimicro Technologies)，包括2台高压输液泵和溶剂梯度洗脱系统、纳升级定量进样阀、UV/Vis柱上检测器、双模式高压电源和数据采集分析系统和C18毛细管色谱柱(Unimicro Technologies)；UV-2102PC紫外-可见分光光度计(UNICO)；EF20pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；CW-2000超声-微波协同萃取仪(上海新拓分析仪器科技有限公司)。

和厚朴酚及厚朴酚标准品(纯度>98%，中国药品生物制品检定所)。H3PO4(广州新港化工)，NaH2PO4(西陇化工)，以上试剂均为分析纯；甲醇、乙腈为色谱纯(安徽时联特种溶剂有限公司)。实验用水为二次蒸馏水。厚朴样品购于广西柳州桂中大药房。

1.2 标准溶液配制

称取适量和厚朴酚、厚朴酚标准品，用甲醇溶解后，分别定容至25 mL，配制成400、260 μg/mL的标准品储备液，使用前根据需要稀释至所需浓度，所有溶液4 ℃避光保存。

1.3 样品前处理

准确称取厚朴样品粉末1.00 g，置于与50 W超声波换能器紧密粘结的250 mL玻璃萃取容器中，加入75 mL甲醇，密封浸泡12 h后，在55 ℃和60 ℃恒温条件下各萃取15 min。萃取完成后，冷却片刻，取出。离心分离，取其上清液，残渣用甲醇清洗2次并分别再次离心，合并3次上清液后过滤得到澄清液，将滤液用旋转蒸发仪小心浓缩并转移至25 mL容量瓶中，用甲醇补充至刻度，密塞，摇匀，作为供试品溶液，供pCEC分析测试。

1.4 加压毛细管电色谱操作条件

色谱柱为EP-100-20/45-3-C18毛细管柱(内径100 μm，总长度45 cm，有效长度20 cm，ODS填料粒径3 μm)，流动相：20 mmol/L NaH2PO4-乙腈(10∶90，V/V)，泵流速：0.035 mL/min，分离电压：-2 kV，检测波长：254 nm。

2 结果与讨论

2.1 缓冲溶液种类及浓度的选择

实验考察了NaH2PO4、H3PO4、NH4Ac和三氟乙酸(TFA)对分离效果的影响。结果表明，以H3PO4、NH4Ac为缓冲溶液时，各峰的灵敏度较低，且峰形不好；以TFA为缓冲溶液，峰的拖尾现象比较严重。当以NaH2PO4作为缓冲溶液时，峰的灵敏度和峰形都获得了较大改善。进一步考察了缓冲溶液浓度的影响，其浓度对分离效果影响不大，但浓度增大时基线噪声大。实验选择20 mmol/L NaH2PO4为缓冲介质。

2.2 有机流动相及其比例的优化

为了获得较好的峰形与分辨率，实验考察了甲醇和乙腈两种有机溶剂对分离效果的影响。结果表明，以乙腈为有机流动相时，分析时间短，且获得了较好的峰形、分辨率和灵敏度。进一步考察了乙腈体积分数为85%、90%和95%时的分离情况，如图2所示。结果表明，和厚朴酚比厚朴酚先出峰，这是因为本实验条件为反相色谱，和厚朴酚的极性较厚朴酚稍大，所以先出峰，且随着乙腈浓度增大，二者的分辨率也随之提高，峰形更好，保留时间缩短；但是分离度有所下降。综合考虑分析时间与分离度的需要，采用90%乙腈作为流动相中的有机相。

2.3 分离电压的影响

施加不同电压条件下和厚朴酚与厚朴酚的分离效果见图3。可以看出，两者的保留时间随着电压的增大而减小，这是因为电渗流随着电压的增加而增大；但是随着电压的增大，厚朴酚的灵敏度也随之下降，这是由于厚朴酚没有完全电离导致的。综合考虑分析时间、灵敏度和柱效等因素，实验采用-2 kV作为分离电压。

图2 流动相中乙腈比例对分离效率的影响Fig.2 Effect of acetonitrile content in mobile phase on separation efficiency mobile phase:20 mmol/L NaH2PO4-acetonitrile;pump rate:0.035 mL/min;separation voltage:-2 kV.1.Honokiol;2.Magnolol.

图3 分离电压对分离效率的影响Fig.3 Effect of separation voltage on separation efficiency mobile phase:20 mmol/L NaH2PO4-acetonitrile(10∶90,V/V);pump rate:0.035 mL/min.1.Honokiol;2.Magnolol.

2.4 泵流速对分离效果的影响

考察了流速分别为0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050 mL/min时对两种酚类物质的分离情况。结果表明，随着泵流速的增大，反压阀的压力也随之增大，分析物的保留时间明显缩短，说明在加压毛细管电色谱中通过增大泵流速可以提高流动相的线速度，缩短分析物的保留时间。但随着泵流速的增大，分离度和灵敏度有所下降。综合考虑分离度、灵敏度和分析时间的需要，本实验中选择泵流速为0.035 mL/min。

2.5 方法的线性关系及检出限

配制和厚朴酚、厚朴酚的系列标准溶液，在最优化条件下进行pCEC测定，每个浓度平行测定3次。以平均峰面积(y)对样品浓度(x，μg/mL)进行线性回归。回归方程、线性范围、相关系数及检出限(S/N=3)见表1。其中检出限采用标准样品逐级稀释进样得到。

表1 厚朴酚与和厚朴酚的线性关系及检出限Table 1 Regression equations,linear ranges and limits of detection(LOD) of magnolol and honokiol

2.6 样品测定和加入回收实验

取1.3节处理好的供试品溶液，将其稀释20倍后进行加压毛细管电色谱分析，平行测定3次，同时进行加入回收实验，平行测定3次。标准品、样品和加标样品的色谱图如图4所示，回收率实验结果见表2。经计算，厚朴酚的回收率为97.09%～101.60%，和厚朴酚的回收率为95.38%～102.40%，相对标准偏差(RSD)均低于1%。表明该方法重现性好,具有一定的准确度。

图4 标准品、样品及加标样品的pCEC谱图 Fig.4 pCEC chromatograms of standards(A),magnoliae officinalis sample(B) and magnoliae officinalis sample spiked with standards(C) 1.Honokiol;2.Magnolol.