液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中3种二苯甲酮类化合物

2015-10-16夏碧琪陈祥准沈祥茹

分析科学学报 2015年5期

夏碧琪，陈祥准，程洁，沈祥茹，沈燕，韩超*

(1.温州出入境检验检疫局，浙江温州 325027；2.温州大学化学与材料工程学院，浙江温州 325035)

PPCPs(Pharmaceuticals and Personal Care Products，PPCPs)是近年来备受关注的一类环境新型污染物，包括抗生素、止痛剂、镇定剂等药物，以及芳香剂、紫外吸收剂、防腐剂等个人护理用品[1 - 3]。PPCPs具有生物累积性等特点，对人类健康具有潜在的危险[4]。二苯甲酮类物质是紫外吸收剂和引发剂，也是有机颜料、医药、香料、杀虫剂的中间体[6]。然而，Rhodes等完成的毒理学试验结果表明，二苯甲酮类物质对试验动物不仅具有致癌作用，而且还有皮肤接触毒性和生殖毒性，从而对人类健康造成严重影响[6]。

目前，二苯甲酮类物质的检测方法有分光光度法[7]、高效液相色谱法[8]、气相色谱-质谱法[9]、液相色谱-质谱法[10,11]等。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法具有较高的选择性和灵敏度[12，13]，本研究采用甲醇超声提取样品，固相萃取柱净化及液相色谱-串联质谱法测定，建立了同时测定水产品中羊栖菜、紫菜、带鱼和黄鱼中2，4-二羟二苯甲酮、2，2′，4，4′-四羟基二苯甲酮、乙-羟基-4-甲氧基二苯甲酮3种二苯甲酮类物质的分析方法，采用同位素内标法定量，方法灵敏度高，定性定量准确。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Agilent1200高效液相色谱仪(美国，Agilent公司)；API 4000三重四极杆质谱仪(美国，AB应用生物系统公司)；MCX固相萃取柱(60 mg/3mL，使用前以5.0 mL甲醇和 1%乙酸水溶液活化)。

2，4-二羟二苯甲酮、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮均购自Accustandard公司(纯度≥99.0%)，2,2′,4,4′-四羟基二苯甲酮购自Chemservice公司(纯度≥98.5%)。内标2，4-二羟二苯甲酮-D5、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮-D5均购自C/D/N Isotopes Inc公司(纯度≥97.5%)。3种二苯甲酮类化合物用甲醇配制成200 μg·mL-1的储备液，使用时用甲醇稀释，配制成5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng·mL-1的混合标准溶液，其中内标浓度均为20.0 ng·mL-1。甲醇、乙腈均为色谱纯(德国MERCK公司)；甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵(美国Alfa Aesar公司)；其它试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

水产品样品购自当地菜场。

1.2 样品处理与净化

1.2.1提取称取样品约2 g(精确至0.01 g)，置于50 mL离心管中，加入0.1 mL同位素内标溶液(1 000 ng·mL-1) 和20 mL甲醇，混匀后，超声提取30 min，提取温度为30 ℃，于4 000 r·min-1离心5 min，过滤并用甲醇定容到25 mL 容量瓶中，待净化。

1.2.2净化取上述待净化溶液10 mL，温度40 ℃氮气吹至近干，先用2 mL甲醇-1%乙酸水溶液溶解残渣，再加入6 mL水，混匀后使该样液以小于1 mL·min-1的流速通过MCX固相萃取柱。样液全部流出后，先用6 mL 1%乙酸水溶液和6 mL 20%甲醇水溶液淋洗，负压抽干，再用4 mL甲醇和2 mL 2%氨水甲醇溶液依次洗脱，洗脱液在40 ℃用氮气吹至近干，用2 mL甲醇溶解残渣，过0.22 μm微孔滤膜后，供LC-MS/MS测定。

1.3 液相色谱-质谱条件

1.3.1液相色谱条件Agilent ZOBRAX C18色谱柱(150×2.1 mm，5 μm)；流动相：A为乙腈，B为0.1%乙酸水溶液。梯度洗脱程序：0～2 min，30%～80%A；2～10 min，80%～80%A；流速：300 μL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

1.3.2质谱条件电喷雾离子(ESI)源：正、负离子扫描；离子源温度500 ℃；电喷雾电压5 000 V；雾化气(GS1) 压力344.5 kPa；辅助气流速(GS2) 275.6 kPa；气帘气压力68.9 kPa；碰撞气压力137.8 kPa。监测模式：多反应监测(MRM)。质谱分析参数见表1。

表1 化合物多反应监测质谱参数Table 1 Optimised MRM parameters for the determination of compounds

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

将标准品配制成200 ng·mL-1溶液，通过流动注射泵连续进样，调谐质谱参数。使用ESI源在正离子和负离子模式下进行全扫描以选择适当的定性、定量离子和电离方式。结果表明：在ESI源的负离子模式下，2，4-二羟二苯甲酮、2,2′,4,4′-四羟基二苯甲酮呈现出最佳响应，准分子离子[M-H]-是响应强度最高的离子。在ESI源的正离子模式下，2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮呈现出最佳响应，准分子离子[M+H]+是响应强度最高的离子。在确定母离子后，采用子离子扫描方式进行二级质谱分析。分别选取丰度较强的主要碎片离子作为定量离子和辅助定性离子。进一步优化碰撞能量、透镜电压等质谱参数，使各分析化合物的响应最大化。质谱参数及母离子和子离子详见表1。

2.2 流动相的选择

分别考察了以甲醇-水和乙腈-水混合体系为流动相，以及在流动相中分别添加甲酸、乙酸、甲酸铵和乙酸铵等溶液对目标物色谱行为和离子化程度的影响。结果发现，流动相中添加乙酸可显著改善3种待测物的灵敏度，故最终以乙腈-0.1%乙酸水溶液为流动相，在梯度洗脱条件下进行分析，MRM色谱图见图1。

图1 标准溶液MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of standards a.2,4-dihydroxybenzophenone；b.2,2′,4,4′-tetrahydroxybenzophenone；c.2,4-dihydroxybenzophenone-D5；d.2-hydroxy-4-methoxybenzophenone；e.2-hydroxy-4-methoxybenzophenone-D5.

2.3 固相萃取柱的选择

本实验分别考察了3个不同品牌的固相萃取柱，结果发现MCX固相萃取柱的净化效果较好，对3种待测物的回收率均可达到82%以上。因此，本实验采用MCX柱进行净化处理。MCX固相萃取柱用5.0 mL甲醇和1%乙酸水溶液活化。

2.4 方法的线性范围与相关系数

实验采用基质匹配标准曲线定量消除基质效应，空白样品按照1.2节前处理，配制一系列混合标准工作溶液，在选定的色谱和质谱条件下进行测定，以分析物与内标物峰面积之比(y)为纵坐标，以分析物与内标物质量浓度之比(x)为横坐标进行回归分析(2，4-二羟二苯甲酮、2,2′,4,4′-四羟基二苯甲酮为定量分析时选择2,4-二羟二苯甲酮-D5为内标物；2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮选择2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮-D5为内标物)。结果表明，2，4-二羟二苯甲酮、2,2′,4,4′-四羟基二苯甲酮和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮在5.0～100.0 ng·mL-1范围内具有良好的线性，其线性方程分别为：y=0.0247x+0.0158(r2=0.9993)；y=0.0331x+0.0724(r2=0.9995)；y=0.0576x+0.0937(r2=0.9996)。