超高效液相色谱-串联质谱法测定兽用中药散剂中喹诺酮类药物的研究

2015-10-16田亚平侯东军曹忠君姜艳彬

分析科学学报 2015年5期

田亚平，陈洋，于雷，侯东军，曹忠君，姜艳彬*

(1.中国动物疫病预防控制中心，北京 102609; 2.铁岭市畜产品安全检测站，辽宁铁岭 112000)

喹诺酮类药物是一类人工合成的具有4-喹诺酮环结构的药物，因其具有抗菌谱广、杀菌力强、吸收快、体内分布广泛、不良反应小，以与其他抗菌药无交叉耐药性等特点，被广泛应用于治疗动物各类感染[1，2]。目前，兽用中药制剂中存在非法大量添加抗生素、抗病毒药等化学药品，喹诺酮类药物就是其中的一种，这不仅易造成动物源性食品中药物残留，且给人们身体健康造成巨大伤害[3]。

目前，喹诺酮类药物残留检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等[4-9]。超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)联用技术，结合UPLC的高分离能力和质谱提供结构信息的功能，具有灵敏度高、选择性强的优势，尤其是串联质谱技术的应用，可以获得丰富、有效的化合物结构信息，建立快速、高效的分析研究体系[10]。本方法旨在建立一种快速简便、专属性强、灵敏度高的UPLC-MS/MS方法，用以测定兽用中药散剂中喹诺酮类药物。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Acquity UPLC超高效液相色谱-Quattro premier XE质谱联用仪(Waters公司)；AE260电子天平(Mettler Toledo公司)；Biofuge Strators高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技)；Organomation Associates氮吹仪(Jnc公司)；VORTEX 1漩涡混合器(IKA公司)；MassLynx v 4.1数据处理软件(Waters公司)；HLB小柱(3 cc，HLB；Waters公司)。

培氟沙星(Pefloxacin)、环丙沙星(Ciprofloxacin)、恩诺沙星(Enrofloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、伊诺沙星(Enoxacin)、吡哌酸(Pipemidic Acid)、萘啶酸(Nalidixic Acid)、西诺沙星(Cinoxacin)、诺氟沙星(Norfloxacin)、达氟沙星(Danofloxacin)、洛美沙星(Lomefloxacin)、二氟沙星(Difloxacin)、沙氟沙星(Sarafloxacin)、司帕沙星(Sparfloxacin)14种对照品，纯度均大于98.0%(Dr．Ehrenstorfer公司)；乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯(Fisher公司)；三氯乙酸为分析纯。实验用水为超纯水。

1.2 混合标准溶液的配制

分别准确称取14种喹诺酮类药物对照品0.0100 g，甲醇溶解，并定容于100 mL容量瓶中，配制成100.0 μg·mL-1的混合标准储备液。准确吸取混合标准储备液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得1.00 μg·mL-1的混合标准工作液。

1.3 供试品

阴性样品：止痢散(爱德森(北京)生物科技有限公司)；四味穿心莲散(江苏省徐州仙潮药业有限公司)。以上两种中兽药散剂均购买于合格厂家，经检测不含喹诺酮类药物。

阳性添加散剂：按照0.5%、1.0%和2.0%的比例在阴性对照散剂中添加14种喹诺酮对照品，混匀。

1.4 样品前处理

称取中药散剂1.0 g，加水10.0 mL，超声溶解。HLB柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，待溶液流至填料上层以下，加5.0 mL样品提取液至HLB柱中，控制流速小于3 mL/min，然后用3 mL水淋洗，抽干，3.0 mL甲醇洗脱，将洗脱液于30 ℃下氮气吹干。残余物用初始流动相2.0 mL溶解，涡旋混匀，以10 000 r·min-1的速率高速离心10 min。取适量上清液，0.45 μm微孔滤膜过滤，供UPLC-MS/MS测定。

1.5 色谱与质谱条件

色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18柱(100×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：A相为甲醇，B相为0.05%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～10.0 min，3.0%～90.0%A；10.0～10.1 min，90.0%～3.0%A；10.1～13.0 min，3.0%A；流速为0.25 mL·min-1；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

质谱条件：电喷雾正离子源；毛细管电压为3.5 kV；锥孔电压为3.0 V；RF透镜电压为0.5 V；离子源的温度为110 ℃；脱溶剂温度为350 ℃；脱溶剂气流速为650 L·h-1；锥孔反吹气流速为50 L·h-1。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

为了提高分析的灵敏度和专一性，选用多反应监测(MRM)模式进行检测，并同时进行定性和定量的双离子通道分析，进一步提高该方法的准确性和专属性。喹诺酮类药物定性和定量离子对列于表 1。

为了提高方法的灵敏度，本实验进行多时间段的MRM(mpMRM)，即按照待测药物的保留时间，分为多个时间段分别进行MRM扫描，具体测定条件见表1。mpMRM数据采集模式在一个循环中检测多个药物，节约分析时间，尤其是mpMRM灵敏度高，能够检测含量较低的待测组分。

表1 14种喹诺酮类药物的保留时间、定性和定量离子对及MRM参数Table 1 Retention time,quantitative and qualitativeion-pair,and MRM parameters of 14 quinolone drug

(续表1)

2.2 方法验证

2.2.1专属性阴性样品中添加14种喹诺酮类药物(10.0 μg·mL-1)，并按照前处理方法进行处理，实验结果表明，14种喹诺酮类药物能和中药散剂中的其他物质完全分离，没有干扰。

2.2.2线性关系和检测限准确吸取适量的混合标准工作液，用流动相稀释成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng·mL-1的系列空白添加试样，然后进行UPLC-MS/MS测定。以各药物定量离子的色谱峰面积(Y)为纵坐标，样品浓度(X，ng·mL-1)为横坐标，绘制标准曲线，并计算检出限(LOD,S/N>3)和定量限(LOQ,S/N>10)，结果见表2。可以看出14种喹诺酮类药物在1.5～200.0 ng·mL-1的浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数(r)均大于0.990。

表2 14种喹诺酮类药物的标准曲线、相关系数、定量限和检测限Table 2 Calibration curves，correlation coefficients,LODs and LOQs of 14 quinolone drug

2.2.3精密度和回收率按照高(2.0%)、中(1.0%)、低(0.5%)3个不同比例，添加14种喹诺酮类药物混合溶液到阴性中药散剂中，每个浓度测定6个样本，按照1.4处理样品，与对照品平行进样分析，用外标法定量，本实验的回收率为95.1%～106.3%，相对标准偏差为2.3%～4.8%。结果表明各样本回收率和精密度符合分析要求。