杨 莉， 刘德龙*， 魏永巨

(河北师范大学化学与材料科学学院，河北石家庄 050024)

鬼臼类中药是小檗科中鬼臼亚科的桃儿七属、山荷叶属、八角莲属及足叶草属药用植物的统称[1]。鬼臼类植物是一类含有显著生物活性和毒性物质的中药，其根茎具有祛风湿、活血止痛、镇咳平喘、祛痰等功能，主要成分鬼臼毒素等芳基四氢萘类木质素具有显著抗肿瘤、抗病毒活性[2]。该类药物的应用历史非常悠久，早在《神农本草经》中就有记载[3]。5%的鬼臼毒素酊剂是世界卫生组织推荐的治疗尖锐湿疣的一线药物[4]。鬼臼类中药一般多为散剂单用、泡酒或开水送服，不宜入煎剂。不同鬼臼类药材用量方面各书记载不一，但古代本草中的剂量大多为1钱(3 g)，尤其强调本品有毒，服用宜慎，孕妇忌服，但屡有过量服用后出现中毒症状甚至导致死亡的病例报道[5]。因此，快速有效地测量人体体液中鬼臼毒素的含量尤为重要。目前报道的测定鬼臼毒素的方法有：紫外分光光度法[6]、 高效液相色谱法[7]、薄层扫描法[8]和荧光法[9,10]等。而利用三维荧光光谱测定中药组分与高效液相色谱相比具有诸多优点[11]。

二阶张量校正是对三维数据阵进行解析，其主要优势是其独特的“二阶优势”，即：即使有未知干扰物共存，亦能够对多个感兴趣组分进行直接快速定量分析。本文探讨利用三维荧光光谱结合二阶张量校正测定中药鬼臼和人体体液中鬼臼毒素的含量。利用化学计量学中基于交替三线性分解(ATLD)方法的二阶校正方法，对中药鬼臼和人体体液中鬼臼毒素含量及回收率进行了准确测定。另外，对比说明了内滤光效应对定量测定鬼臼毒素的影响及其校正方法。

1 方法和原理

1.1 三线性模型[12]

(1)

1.2 交替三线性分解(ATLD)方法[13,14]

根据以下迭代式子求A，B，C：

式中，diagm(·)表示取矩阵对角元素为一列向量；A+，B+，C+分别表示A、B、C的Moore-Penrose广义逆。而a(i)，b(j)，c(k)分别为相对荧光激发矩阵A、相对荧光发射矩阵B以及相对浓度矩阵C的行矢量，每次迭代过程中，对A和B逐列归一化处理。

1.3 核一致诊断法确定荧光组分数[14]

(5)

1.4 内滤光效应

内滤光效应(IFE)[16]是溶液中共存的其他吸光物质吸收了一部分激发光，或吸收了一部分发射光而引起荧光强度降低的现象。当溶液的紫外吸光度大于0.05，内滤光效应会使标准曲线弯曲，从而不能从三维荧光图谱中得到正确的信息。关于内滤光效应的校正方法已经有文献报道[17]，主要有稀释法和数学校正法。数学校正法是根据公式：I0=I×100.5b(Aex+Aem)校正待测溶液的荧光强度。其中，I0是校正后的荧光强度；I是校正前的荧光强度；Aex和Aem分别是激发和发射波长处的吸光度；b是比色皿厚度，本文均使用1 cm石英比色皿。

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

F-4600荧光分光光度计(日本,日立公司);U-3010紫外-可见分光光度计(日本,日立公司)。

鬼臼毒素储备液：准确称取2.380 mg鬼臼毒素标准品，用色谱纯的甲醇配成47.6 μg/mL储备液，使用时用水稀释；中药鬼臼储备液：将中药鬼臼粉碎后，过40目筛，准确称取0.5000 g用色谱纯甲醇溶解浸泡24 h，过滤后定容到25 mL容量瓶中，使用时稀释；HAc-NaAc缓冲溶液：0.2 mol/L(pH=4.6)；NaCl溶液：1.0 mol/L。

2.2 实验方法

在一系列10 mL容量瓶中，分别加入2 mL 缓冲溶液，1 mL NaCl溶液，不同浓度的鬼臼毒素标准溶液或中药鬼臼提取液及一定量的甲醇。测定荧光强度时，激发波长范围为200～320 nm，发射波长范围为280～410 nm，波长间隔5 nm，狭缝宽度设置为5.0/5.0 nm，扫描速度为1 200 nm/min。

C1～C5号为校正集，其中鬼臼毒素的浓度为0.476、0.952、1.428、1.904、2.380 μg/mL；P1～P4号为不同浓度的中药鬼臼提取液；X1～X5号为血浆背景下加入不同浓度的鬼臼毒素标准液，血浆稀释500倍；N1～N5号为尿液背景下加入不同浓度的鬼臼毒素标准液，尿液稀释100倍；E系列是二阶标准加入实验，E1～E5号为平行预测集，加入20.00 μg/mL的中药鬼臼，E6～E11为二阶加入标准集，加入20.00 μg/mL的中药鬼臼和不同浓度的鬼臼毒素，鬼臼毒素浓度分别为0.238、0.476、0.714、0.952、1.190、1.428 μg/mL；0号作为空白样。

3 结果与讨论

3.1 鬼臼毒素的光谱特性与影响因素

图1 鬼臼毒素的三维荧光光谱Fig.1 Three-dimensional fluorescence spectra of podophyllotoxin

鬼臼毒素的三维荧光光谱如图1所示，图中有两个荧光峰分别位于λex/λem=235/325 nm和λex/λem=285/325 nm，这两个峰的荧光激发波长不同，但发射波长相同。实验发现，pH在2～8的范围内鬼臼毒素具有稳定的荧光强度，本实验选择在pH=4.6的环境中进行测定。不同体积的甲醇对体系的荧光强度有明显影响，甲醇含量在1%～10%范围内鬼臼毒素的荧光强度比较稳定，而甲醇含量在10%～60%范围内鬼臼毒素的荧光强度随甲醇含量的增加逐渐增强，实验中固定甲醇含量为5%。

3.2 组分数估计

利用核一致诊断法对体系样进行组分数估计，鬼臼中鬼臼毒素含量计算得出的荧光组分数是2，其中一个组分对应于鬼臼毒素，另一个对应于背景干扰,如图2A所示。血浆体系中计算得出的荧光组分数是2，其中一个组分对应于鬼臼毒素，另一个对应于血浆中的荧光组分,如图2B所示。尿液体系中计算得出的荧光组分数是2，其中一个组分对应于鬼臼毒素，另一个对应于尿液中的荧光组分,如图2C所示。

图2 利用核一致诊断法估计组分数Fig.2 The core consistency diagnostic(CORCONDIA) test for determining the number of components in analytical systems(A)：podophyllum samples;(B):plasma samples;(C):urine samples.

3.3 鬼臼毒素解析光谱与定性分析

利用ATLD方法分解三维荧光光谱数据得到相对激发光谱阵A和相对发射光谱阵B，如图3所示。从图3可以看出，中药鬼臼成分复杂，背景干扰与鬼臼毒素的荧光激发及发射光谱有较强的重叠，利用ATLD方法分辨得到中药鬼臼中鬼臼毒素的激发-发射光谱与真实光谱十分吻合；在血浆或尿液存在的情况下，血浆或尿液的荧光激发及发射光谱与鬼臼毒素的荧光激发及发射光谱也有严重的重叠，利用ATLD方法分辨得到血浆或尿液背景下鬼臼毒素的激发-发射光谱与真实光谱也十分吻合，解析结果较好。

图3 ATLD法分辨得到的鬼臼中鬼臼毒素光谱(A1,B1)，血浆背景下的鬼臼毒素光谱(A2,B2)，尿液背景下的鬼臼毒素光谱(A3,B3)Fig.3 The resolved spectral profiles of podophyllotoxin by using ATLD method in podophyllum samples (A1,B1),human plasma(A2,B2),and human urine samples (A3,B3) (A) Excitation and (B) emission.The solid,point and dotted lines represented the resolved spectral profiles,the actual ones and interference,respectively.

3.4 鬼臼毒素定量分析

利用ATLD方法解析三维荧光光谱数据，用校正集和预测集进行线性回归得到鬼臼中鬼臼毒素的解析浓度及含量如表1所示；血浆和尿液背景下的解析浓度及回收率如表2所示。

表1 中药鬼臼中鬼臼毒素的测定结果Table 1 Quantitative determination of podophyllotoxin in podophyllum

表2 血浆和尿液背景下鬼臼毒素的测定结果Table 2 Quantitative determination of podophyllotoxin in plasma and urine

(续表2)

为了验证结果的准确性测定了中药鬼臼中鬼臼毒素的回收率，结果如表3所示。另外，利用二阶标准加入法对鬼臼中鬼臼毒素的含量进行了测定，结果如表4所示。

表3 中药鬼臼中鬼臼毒素的回收率测定结果Table 3 Recovery of podophyllotoxin in podophyllum

从表1中可知，鬼臼中鬼臼毒素的含量为4.855%±0.14%，二阶标准加入法测定的含量为4.558%±0.05%，两种方法测定的含量很接近，说明测定结果准确可靠。从表3中的回收率可以看出回收率也令人满意。从表2可以看出，在有血浆或尿液干扰存在的情况下得到的回收率也较好。说明ATLD方法可以在有严重背景干扰存在的情况下准确地测定鬼臼中鬼臼毒素的含量，同时也可以准确地测定人体体液中鬼臼毒素的含量，这具有重要的应用价值。

3.5 内滤光效应的校正

实验说明血浆和尿液的吸光度远大于0.05，血浆在280、215 nm的吸光度分别为1.88和1.456，尿液在280、215 nm的吸光度为0.180和0.600。内滤光效应会影响鬼臼毒素的三维荧光数值，需要进行校正，表5列出了血浆体系校正前后的结果对比。从结果可见，校正前的平均回收率为94.3%±9.0%，校正后的平均回收率为101.4%±3.9%，说明内滤光效应的校正是必要的。所以本文的血浆和尿液体系采用的是校正后的数据。

表5 吸光度校正与未校正时鬼臼毒素定量结果的比较Table 5 Quantitative results of podophyllotoxin in podophyllum with and without absorbance correction resolved

4 结论

本文利用三维荧光光谱分析结合化学计量学交替三线性(ATLD)方法，在有未知干扰组分共存的情况下，对中药鬼臼和人体体液中鬼臼毒素含量进行了直接快速定量分析，获得了较好的结果。同时，对血浆和尿液中的内滤光效应用公式：I0=I×100.5b(Aex+Aem)进行了吸光度校正，结果显示校正后的定量测定结果更好。中药材成分复杂，用传统的方法进行检测步骤繁琐、成本高，而三维荧光与化学计量学中的二阶校正方法相结合具有简单、快速、高效、无需使用大量有毒溶剂及操作费用低等特点，可以作为一种强有力的分析策略及手段，应用于中药复杂体系中目标物的定量分析中。化学计量学方法与三维荧光相结合是荧光定量分析技术的一个重要发展方向，显示了化学计量学在中药复杂体系定量分析中的重要作用和应用潜力。