赵　莹， 赵丽亚， 晁天柱， 张　蓉， 邢正弘， 陈国强， 肖君华

（1. 上海西普尔-必凯实验动物有限公司， 上海 201203；2. 上海实验动物研究中心， 上海 201203； 3. 东华大学生物科学与技术研究所， 上海 201620）

染色体替换系的方案构建及评价

赵莹1，2， 赵丽亚1，2， 晁天柱3， 张蓉1，2， 邢正弘1，2， 陈国强1，2， 肖君华3

（1. 上海西普尔-必凯实验动物有限公司， 上海 201203；2. 上海实验动物研究中心， 上海 201203； 3. 东华大学生物科学与技术研究所， 上海 201620）

目的 为缩短复杂性状相关基因精细定位时间，构建染色体替换系（CSSs），并对构建方案进行评价。 方法 以供体小鼠作为母本、受体C57BL/6小鼠作为父本进行杂交， 获得N1代小鼠。将N1代雄性小鼠与C57BL/6雌性小鼠杂交， 获得N2代小鼠。选择N2代1号染色体非重组的雄性小鼠与C57BL/6雌性小鼠回交， 获得N3代回交小鼠； 通过短串联重复序列（STR）与单核苷酸多态性（SNP）对每代一定数量的子代进行遗传分析， 依次回交10代， 选择N10代1号染色体未重组的样本， 雌雄交配， 挑选1号染色体为纯合且来自供体品系的子代小鼠， 用于繁殖纯合后代。通过基因芯片扫描鉴定替换系的纯合度，并与期望值比较。 结果 根据构建的CSSs方案， 得到2个不同的CSSs， 通过基因芯片扫描得到的替换系纯合度与期望值接近。 结论 构建的CSSs方案可完成（部分）近交系小鼠品系目标染色体替换， 供体品系背景基因组中99.59%以上已被受体C57BL/6小鼠替换，证明构建的CSSs方案可行。

染色体替换系（CSSs）； 方案构建； 评价； 非重组率

小鼠与人类共患许多受到遗传调控的常见疾病，其中既有单基因参与调控的疾病，也有多基因参与调控的疾病，而多基因参与调控的疾病属于复杂性状。为了定位复杂性状相关基因， 目前主要有三种方法： 第一，传统方法，两个品系通过回交N2代或杂交N2代初步鉴定相应的数量性状基因座（QTL）［1］， 然后通过构建同类系鉴定相应QTL［2］。最后， 通过精细定位鉴定QTL。连锁定位和同类系构建需要10～15代， 对于小鼠来说大概需要3～5年， 对于大鼠来说则需更长时间［3］。第二， 构建超大规模重组近交系（Recombinant inbred lines）， 将C57BL/6J、A/J、CAST/Ei、NOD/LtJ、NZO、WSB/Ei、PWK/Ph 与129S1/SvImJ等8个品系互相杂交20代以上［4］，形成上千个重组近交系，形成的重组近交系包含有来自8个近交系的基因。第三，染色体替换系（chromosome substitution strain， CSSs）［3］，CSSs主要是由一个受体品系与一个供体品系构建，CSSs的一条染色体来自供体品系，其余都是以受体品系为背景［3，5］，通过CSSs与受体品系有限的回交或杂交，比较CSSs与背景品系在感兴趣表型的差异，从而鉴定相应染色体上的基因座。CSSs已经用于鉴定几个复杂性状的QTL，例如，明暗场选择、开放区域选择、血清中甾醇类和血清中部分氨基酸的浓度都与1号染色体有关［6］； 肥胖和动脉粥样硬化是由环境和遗传因素引起的，发现与动脉粥样硬化相关的QTL有两个，与体质量有关的QTL有数十个，并找到三个与能量消耗有关的QTL和一个与食物吸收相关的QTL［7］； 睾丸癌是目前影响年轻男性健康的一种常见癌症，已发现与睾丸癌有关的QTL定位于19号染色体［8］； 与焦虑有关QTL定位于1号、4号、6号、15号、17号染色体［9］； 与性发育有关的QTL定位于6号、13号染色体［10］； 与骨质疏松有关的QTL定位于1号染色体［11］。不同数量性状相关疾病的QTL位于不同染色体上。

小鼠1号染色体是目前复杂性状研究成果最集中的染色体， 在已知的4 000多个QTL中， 有400多个被定位在1号染色体（informatics.jax.org）， 占总数的10%，虽然有如此多QTL被成功定位，但明确鉴定导致复杂性状差异的基因却只有20个左右［12］。其根本原因是小鼠遗传资源的积累与研究导致了复杂性状初步定位的蓬勃发展； 而另一方面，初步定位到QTL后对基因的精细定位却举步维艰［13］，因此构建染色体替换系非常重要。

1　材料与方法

1.1动物饲育

选择C57BL/6作为受体品系，C3H/He、FVB/ N为供体品系。所有动物均为SPF级，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司［SCXK（沪）2008-0016］。所有动物饲养于上海西普尔-必凯实验动物有限公司［SYXK（沪）2008-0058］，动物实验遵守1988年《实验动物管理条例》。

1.2构建染色体替换系

以供体小鼠作为母本、受体C57BL/6品系小鼠作为父本进行杂交，获得N1代小鼠。将N1代雄性小鼠与C57BL/6品系雌性小鼠杂交，获得N2代小鼠。通过构建的STR与SNP分型方案鉴定N2代小鼠1号染色体的重组情况［14-16］，以雄性小鼠为分型对象，选择1号染色体上所有位点都未重组的样本； 将选择到的雄性小鼠与C57BL/6品系雌性小鼠回交，获得N3代回交小鼠； 依次回交10代［17］； 从而获得2个不同的染色体替换系。对N10代染色体替换系雌雄小鼠分型，挑选1号染色体未重组的样本，雌雄交配，鉴定其后代1号染色体的重组情况，选择1号染色体为纯合且来自供体品系的子代小鼠，即为得到的小鼠染色体替换系（图1）。

图1　构建染色体替换系方案Figure 1 The strategy for constructing CSSs

1.3基因组背景纯度鉴定

选择含有1 449个SNP位点的芯片， 通过基质辅助激光吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术， 对2个CSSs N6代和N10代进行基因组背景纯度鉴定，每个品系每个代数选择一个样本，共4个样本，根据所得数据对该染色体替换方案进行评估，该步实验由晶能生物技术有限公司完成。

1.4染色体替换系N2代的非重组率及替换系子代种群大小

在构建CSSs 过程中，每个品系需要保证有5～8只雄性传代小鼠，才能在理想时间内获得数量足够大的子代群体。通过构建的STR与SNP基因分型方法鉴定每个替换系的N2代小鼠1号染色体的重组情况，分型对象为雄性小鼠，选择1号染色体上所有位点都未重组的样本，非重组率为每个品系筛选出的样本数占所有用于分型的样本总数，替换系子代种群大小等于需要传代的小鼠数量乘以2再除以非重组率。

1.5替换系子代小鼠体质量称量

从N1代到N10代， 对每个品系每代小鼠10日龄和20日龄子代小鼠称重，考察体质量随代数的变化情况。

1.6统计学处理

2　结果

2.1构建的2个染色体替换系及基因组背景纯度

借助经典遗传学， 以供体做母本， 受体C57BL/6品系做父本，杂交得到N1子代，该N1代雄性小鼠的X染色体来自于供体，Y染色体来自于受体C57BL/6， 而N1代雌性小鼠的X染色体为杂合子，一条来自于供体， 一条来自于受体C57BL/6，因此N1代使用雄性小鼠传代，即N1代雄性小鼠与受体C57BL/6品系回交，得到的N2代雄性小鼠的线粒体和X染色体都来源于受体C57BL/6背景，从N3代采用雄性小鼠或者雌性小鼠与受体C57BL/6回交传代，得到子代的线粒体和性染色体都是来源于受体C57BL/6背景，最终达到替换1号染色体的目的。通过构建的CSSs方案， 目前已成功培育了2个染色体替换系，2个CSSs 分别为： C57BL/6.C3H/ He-Chr1、C57BL/6.FVB/N-Chr1（见图2）。替换系的线粒体和性染色体完全来自C57BL/6，其1号染色体已被不同的供体品系替换，同时背景基因组的纯度已达到期望值。

利用1 449个高密度SNP基因芯片对2个染色体替换系N6代、N10代进行基因组纯度鉴定，C57BL/6.C3H/He-Chr1背景基因组N6代和N10代纯度分别为98.90%和99.65%，C57BL/6.FVB/N-Chr1背景基因组N6代和N10代纯度分别为99.38%和99.59%（表1）。

图2　两个染色体替换系示意图Figure 2 The diagram of two chromosome substitution strains

2.2染色体替换系N2代的非重组率及替换系子代种群大小

通过构建的STR与SNP基因分型方法对2个染色体替换系N2代小鼠进行分型，筛选出1号染色体未重组的样本（表2）。发现近交系来源小鼠1号染色体的平均非重组率为17.7%。其中， C57BL/6. C3H/He-Chr1替换系的非重组率为15.5%， C57BL/6. FVB/N-Chr1替换系的非重组率为23.8%。自N1代起选用雄性小鼠传代， 每代需5～8只小鼠传代， 结合本方案中每个替换系N2代1号染色体非重组率的实际值， C57BL/6.C3H/He-Chr1与C57BL/6.FVB/N-Chr1替换系每代分别需要65～104只和42～68只个体。同时，N2代的非重组率及实际种群数量也为每个替换系后续回交繁殖群体数量的控制提供了依据。

表1　基因芯片检测结果Table 1 The result of microarray detection

2.3各品系替换过程中子代的体质量分析结果

每个染色体替换系每代10日龄和20日龄小鼠的平均体质量和标准差如表3、表4。

C57BL/6.C3H/He-Chr1和C57BL/6.FVB/N-Chr1替换系的N1代10日龄与20日龄体质量均高于其它代数的10日龄与20日龄体质量，且有显著差异（P＜0.05）。从N2代到N10代， C57BL/6.C3H/He-Chr1 和C57BL/6.FVB/N-Chr1替换系每代雄鼠与雌鼠的10日龄与20日龄体质量基本处于一条直线上，无代数反应关系（P＞0.05）。

表2　各替换系N2代1号染色体的非重组率Table 2 The rate of non-recombination of N2 mice in each chromosome 1 substitution strain

表3　各品系替换过程中子代10 d的体质量Table 3 The body weight for 10 days progeny mice in chromosome 1 substitution strains

表4　各品系替换过程中子代20 d的体质量Table 4 The body weight for 20 days progeny mice in chromosome 1 substitution strains

2.4CSSs的方案评价

染色体替换过程中各代基因组背景纯度的理论值可以由计算而得［10］，N1代可替换约50%的基因组，即N1代C57BL/6遗传背景的纯度理论值约为50%。以此类推， N2代到N10代C57BL/6遗传背景的纯度理论值分别为75.00%、87.50%、93.75%、96.88%、98.44%、99.22%、99.61%、99.81%、99.90%。N6代纯度理论值已接近99%，并趋于稳定， 因此选N6代与N10代进行纯合度检测。根据SNP基因芯片扫描结果， C57BL/6.C3H/He-Chr1替换系N6代与N10代的纯合度分别为98.90%、99.65%，C57BL/6.FVB/N-Chr1替换系N6代与N10代的纯合度分别为99.38%、99.59%。2个CSSs N6代的实际纯合度均高于理论值98.44%，2个CSSs N10代的实际纯合度与理论值99.90%接近，证明文中构建的染色体替换方案可行。

3　讨论

在本研究中，主要关注CSSs的方案构建，通过供体与受体的杂交后代不断与受体回交，采用STR与SNP遗传位标鉴定子代的1号染色体重组情况，筛选出1号染色体未重组的样本，在替换过程中首先解决线粒体、X染色体、Y染色体替换的难题，通过1号染色体的非重组率估计每个替换系子代的种群数量，并通过基因芯片扫描进一步评价该方案，CSSs系的构建需要大量的分型工作和饲养工作， 大概需要2～3年，以及大量的费用，但是一旦形成，它们对于公众的染色体研究就是一个可持续和非常有价值的资源。到目前为止，文献中报道［3］已经构建的CSSs主要有： CSS C57BL/6J-chr （i）A/J，i代表1～21，CSS 129/Sv-chr19MOLF/Ei。

另外，有报道［18］利用亨廷顿舞蹈病的疾病修饰基因座评估CSSs， C57BL/6J-chr10A/J/NaJ（CSS10）与HdhQ111基因敲除小鼠C57BL/6J杂交，对F1子代检测， 证实染色体替换系在体质量上有明显差异，HdhQ111基因敲除小鼠与肝和核内包涵体形成中CAG基因稳定性有关。另外Courtney 等［19］利用C57BL/6J-chr10A/J/NaJ（CSS14）染色体替换系来评估小鼠的内在运动能力， 将QTL定位在14号染色体，并对C57BL/6J-chr10A/J/NaJ（CSS14）与C57BL/6J回交的F2代进行连锁分析， 在14号染色体上找到多个相关QTL， 证明了CSSs可大大缩短基因定位时间。

在染色体替换过程中，假定各种染色体交换之间互不干扰，根据染色体长度，子代染色体的非重组率期望值公式为1/2e-d/100［3］， d表示染色体长度， 小鼠1号染色体长度约为112.5 cM， 则小鼠1号染色体的非重组率期望值为16%。但是各种染色体交换之间并不是完全无关，且各品系间遗传背景也有差异，因此小鼠子代染色体的实际非重组率与期望值略有差异，捷克、美国及日本等科学家进行亚种间染色体替换的研究显示，供体为A/J， 受体为C57BL/6的1号染色体实际非重组率为16%［2］。本方案中小鼠1号染色体的平均非重组率为17.7%，与文献报道结果一致。

染色体替换系群由于仅仅对比一条染色体对性状的贡献，基因组其它基因调控因素被完全均一化，因此是研究微效基因独特资源。因此，该类资源的研发可加速人类疾病相关基因的研究步伐，具有重大科学应用价值与良好社会效益。

［1］Lander ES， Botstein D. Mapping mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps［J］. Genetics，1989， 121（1）：185-199.

［2］Snell GD. Methods for the study of histocompatibility genes ［J］. J Genet， 1948， 49（2）：87-108.

［3］Nadeau JH， Singer JB， Matin A， et al. Analysing complex genetic traits with chromosome substitution strains［J］. Nat Genet， 2000， 24（3）：221-225.

［4］Peters LL， Robledo RF， Bult CJ， et al. The mouse as a model for human biology： A resource guide for complex trait analysis ［J］. Nat Rev Genet， 2007， 8（1）：58-69.

［5］Churchill GA， Airey DC， Allayee H， et al. The collaborative cross， a community resource for the genetic analysis of complex traits［J］. Nat Genet， 2004， 36 （11）：1133-1137.

［6］Singer JB， Hill AE， Burrage LC， et al. Genetic dissection of complex traits with chromosome substitution strains of mice ［J］. Science， 2004， 304（5669）：445-448.

［7］Spiezio SH， Amon LM， Mcmillen TS， et al. Genetic determinants of atherosclerosis， obesity， and energy balance in consomic mice［J］. Mamm Genome， 2014， 25（11-12）：549-563.

［8］Youngren KK， Nadeau JH， Matin A. Testicular cancer susceptibility in the 129.MOLF-Chr19 mouse strain： additive effects， gene interactions and epigenetic modifications［J］.Hum Mol Genet， 2003， 12（4）：389-398.

［9］Singer JB， Hill AE， Nadeau JH， et al. Mapping quantitative trait loci for anxiety in chromosome substitution strains of mice［J］. Genetics， 2005， 169（2）：855-862.

［10］ Krewson TD， Supelak PJ， Hill AE， et al. Chromosomes 6 and 13 harbor genes that regulate pubertal timing in mouse chromosome substitution strains［J］. Endocrinol， 2004， 145（10）：4447-4451.

［11］ Beamer WG， Shultz KL， Ackert-Bicknell CL， et al. Genetic dissection of mouse distal chromosome 1 reveals three linked BMD QTLs with sex-dependent regulation of bone phenotypes［J］. J Bone Miner Res， 2007， 22（8）：1187-1196.

［12］ Korstanje R， Paigen B. From QTL to gene： the harvest begins ［J］. Nat Genet， 2002， 31（3）：235-236.

［13］ Laurie CC， Nickerson DA， Anderson AD， et al. Linkage disequilibrium in wild mice［J］. PLoS Genet， 2007， 3（8）：e144.

［14］ Xu J， Zhao Q， Du P， et al. Developing high throughput genotyped chromosome segment substitution lines based on population whole-genome re-sequencing in rice［J］. BMC Genomics， 2010， 11（1）：656-669.

［15］ 晁天柱， 陈国强， 赵莹， 等. 用于“野生小家鼠来源一号染色体替换系”构建的PCR- LDR分型系统［J］. 中国实验动物学报， 2011， 19（5）：372-376.

［16］ 赵丽亚， 赵莹， 邢正弘， 等. 采用STR和SNP对3个1号染色体替换系筛选比较［J］. 实验动物与比较医学， 2012， 32 （5）：396-400.

［17］ Rogner UC， Avner P. Congenic mice： cutting tools for complex immune disorders［J］. Nat Rev Immunol， 2003， 3（3）：243-352.

［18］ Ramos EM， Kovalenko M， Guide JR， et al. Chromosome substitution strain assessment of a Huntington’s disease modifier locus［J］. Mamm Genome， 2015， 26（3-4）：119-130.

［19］ Courtney SM， Massett MP. Effect of chromosome substitution on intrinsic exercise capacity in mice［J］. Version 2. Fl000Res， 2014， 3（9）：1-15.

Construction and Evaluation of Chromosome Substitution Strains

ZHAO Ying1，2， ZHAO Li-ya1，2， CHAO Tian-zhu3， ZHANG Rong1，2，XING Zheng-hong1，2， CHEN Guo-qiang1，2， XIAO Jun-hua3
（1. Sino-British SIPPR/BK Laboratory Animal LTD.， CO， Shanghai 201203， China；2. Shanghai Laboratory Animal Research Center， Shanghai 201203， China；3. Institute of Biological Sciences and Biotechnology， Donghua University， Shanghai 201620， China）

Objective To shorten the fine-structure mapping time， construct and evaluate the programme of chromosome substitution strains （CSSs） . Methods The rst step required making hybrids between C57BL/6 male mice and donor female mice. N1 hybrids male mice were backcrossed to host C57BL/6 female mice. Progeny with a non-recombinant chromosome derived from donor strain， in this case chromosome 1， were identified in this and subsequent backcrosses. N2 Male mice were backcrossed to host C57BL/6 female mice at each generation. A certain number of progeny per generation was screened with short tandem repeat （STR） and single nucleotide polymorphism （SNP）. These mice were backcrossed to host C57BL/6 at each generation until tenth generation. At the tenth backcross generation males and females with the non-recombinant chromosome derived from donor mice were intercrossed. Progeny of this intercross that were homozygous （homosomic） for chromosome 1 were used to propagate the homosomic strain. The homozygosity of CSSs was identified through scanning the whole genomic by microarray to compare with expected proportion. Results We have constructed two CSSs by the programme that had been constructed. The actual homozygosity of progeny with microarray was approaching the expected. Conclusion The constructed CSSs confirmed the replacement of target chromosome and over 99.59% chromosome segments from host C57BL/6. This breeding program to generate a CSSs panel proved to be feasible.

Chromosome substitution strains （CSSs）； Construct the programme； Discuss；Rate of non-recombination

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0478-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.010

2015-06-05

上海市科学技术委员会科研计划项目（12140900400、13140900302）

赵莹（1982-）， 女， 助研， 硕士， 从事群体遗传学及药物毒性安全评价研究。E-mail： 12414863@qq.com