何大伟， 倪程佩， 王禹斌， 王　婧， 周正宇

（苏州大学实验动物中心， 苏州 215123）

1，25-二羟基维生素D3对链脲佐菌素致胰岛素瘤细胞损伤的保护与修复作用

何大伟， 倪程佩， 王禹斌， 王婧， 周正宇

（苏州大学实验动物中心， 苏州 215123）

目的 初步探讨1，25-二羟基维生素D3（1，25-（OH）2D3）对链脲佐菌素（STZ）所致大鼠胰岛素瘤（INS-1）细胞损伤的保护与修复作用。方法 将INS-1细胞接种于培养板中，置于CO2培养箱中进行培养，药物干预后，应用细胞计数试剂盒（CCK8）检测细胞增殖活力，ELISA法分别检测培养液中的胰岛素浓度、丙二醛（MDA）浓度和总抗氧化能力（T-AOC）。结果 1，25-（OH）2D3可以促进INS-1细胞的活力和胰岛素的分泌（P＜0.01）。STZ所致模型组的细胞活力降低（P＜0.001），胰岛素分泌量减少（P＜0.01），MDA含量明显升高（P＜0.01），T-AOC能力下降（P＜0.01）。与STZ组比较，1， 25-（OH）2D3保护组与修复组在不同程度上改善了上述指标（P＜0.01）。结论 1，25-（OH）2D3可以促进INS-1细胞分泌胰岛素，对STZ损伤的胰岛细胞具有一定的保护与修复作用。

1， 25-二羟基维生素D3（1， 25-（OH）2D3）； 胰岛素瘤（INS-1）细胞； 链脲佐菌素（STZ）； 胰岛素

随着世界人口老龄化，糖尿病已成为一种常见病和多发病，严重危害人类健康。近年来，随着人们对维生素D的不断深入研究，发现维生素D缺乏与Ⅰ型糖尿病及Ⅱ型糖尿病有一定联系， 长期补充维生素D可以降低这些疾病发生的风险［1-3］，但具体作用机制尚未阐明。大鼠胰岛素瘤（INS-1）细胞是一种来自大鼠胰岛素瘤的细胞株，可以稳定地分泌胰岛素，是研究胰岛细胞功能的理想细胞［4］。本实验应用维生素D的活性形式1， 25-二羟基维生素D3（1， 25-（OH）2D3），观察其对链脲佐菌素（STZ）致INS-1细胞损伤的保护和修复作用，并初步探讨其作用机制，为维生素D预防和治疗糖尿病提供一定的实验依据。

1　材料与方法

1.1材料

INS-1细胞， 购自上海拜利生物科技有限公司；1， 25-（OH）2D3、链脲佐菌素（STZ）和β-巯基乙醇均购自Sigma公司，RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶均购自Gibco公司，大鼠胰岛素检测试剂盒、丙二醇（MDA）和总抗氧化（T-AOC）试剂盒均购自上海沪尚生物科技有限公司，细胞计数试剂盒（CCK8）购自DOJINDO公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养使用含体积分数为10%的胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，1 mmol/L丙酮酸钠，50 μmol/L β-巯基乙醇， 1×105IU/L青霉素和100 mg/L 链霉素的RPMI 1640培养基培养INS-1细胞。从液氮取出冻存的细胞迅速放入37 ℃恒温水浴锅，快速摇晃冻存管使之在2 min内融化。然后，用酒精棉球擦拭冻存管外周后拿进超净台，将细胞悬液转至含有4 mL 1640完全培养基的15 mL离心管中，1 000 r/min，离心5 min后，弃上清，加入10 mL 1640完全培养基混匀后，转移到直径为10 cm的培养皿中， 并置于37℃， 5% CO2饱和湿度的恒温箱中培养。观察细胞状态， 每2 d换液一次，待细胞长至60%～80%时，弃去培养基，PBS 洗2次， 加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化1 min后， 加完全培养基终止消化， 将细胞悬液以1 000 r/min，离心5 min后，按1∶3进行传代。

1.2.2CCK8检测细胞活力将浓度7×105个/mL 的INS-1细胞接种至96孔板，100 μL/孔，每组6个重复孔，在培养箱中培养18 h后进行药物干预，待药物干预结束后，每孔加入10 μL CCK8，孵育1～3 h后，用全自动酶标仪测450 nm波长时各孔的D值。

1.2.3葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）弃去培养液， 用PBS洗涤各组细胞2次， 加入含2.8 mmol/L葡萄糖的克-林二氏重碳酸盐（KRB）缓冲液孵育1 h，再更换为含有20 mmol/L葡萄糖的KRB缓冲液孵育1 h后，收集上清。胰岛素分泌水平的测定根据ELISA检测试剂盒说明书进行操作，最后计算出胰岛素在高糖刺激后的分泌水平与基础状态分泌水平的比值。

1.2.4不同浓度的1，25-（OH）2D3对INS-1细胞的胰岛素分泌和细胞活性的影响将浓度7×105个/mL 的INS-1细胞随机分为正常对照组、1，25-（OH）2D3组（包含10-6mmol/L组、10-7mmol/L组、10-8mmol/L组、10-9mmol/L组）分别接种于24孔板和96孔板，每组6个重复孔，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的1，25-（OH）2D3，继续培养24 h后，分别测定GSIS和细胞活力。

1.2.51，25-（OH）2D3对STZ致INS-1细胞损伤的影响使用上述方法将INS-1接种培养板， 并随机分为正常对照组、STZ 5 mmol/L组、保护组［1，25-（OH）2D3 10-7mmol/L+STZ 5 mmol/L］、修复组（STZ 5 mmol/L+ 1，25-（OH）2D310-7mmol/L）， 每组6个重复孔。待细胞完全贴壁后， 保护组先加入浓度为10-7mmol/L 1，25-（OH）2D3培养24 h，再加入5 mmol/L的STZ培养3 h； 修复组先加入5 mmol/L的STZ作用3 h后，再加入浓度为10-7mmol/L 1， 25-（OH）2D3培养24 h； STZ组加入5 mmol/L的STZ作用3 h。干预结束后，分别测定各组胰岛素的分泌水平和细胞活力， MDA的生成和T-AOC能力的检测根据ELISA检测试剂盒说明书进行操作。

1.3统计学分析

所有数据均采用SPSS 17.0软件进行统计分析，t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。每组实验都独立重复3次。

2　结果

2.1不同浓度的1，25-（OH）2D3对INS-1细胞胰岛素分泌和细胞活性的影响

基础葡萄糖状态下， 各组细胞分泌的胰岛素水平和细胞活性无显著差异， 高糖状态下， 10-7mmol/L 的1，25-（OH）2D3处理组的INS-1细胞分泌的胰岛素水平明显增加（P＜0.01）（表1）； 且10-7mmol/L组的INS-1细胞活性最高（P＜0.01）（表2）。

2.21，25-（OH）2D3对STZ致INS-1细胞损伤的影响

基础和高糖状态下， STZ组的INS-1细胞分泌的胰岛素水平和细胞活性明显低于正常对照组；而保护组和修复组的INS-1细胞分泌的胰岛素水平和细胞活性较STZ组有明显的增加（表3， 表4）。与正常对照组相比， STZ组的MDA生成量升高， T-AOC能力下降； 而与STZ组相比， 保护组和修复组的MDA生成量明显下降，T-AOC能力显著升高（表5）。

表1　不同浓度的1，25-（OH）2D3对INS-1细胞胰岛素分泌的影响Table 1 Effects of different concentrations of 1，25-（OH）2D3 on insulin secretion of INS-1 cells

表2　不同浓度的1，25-（OH）2D3对INS-1细胞活性的影响Table 2 Effects of different concentrations of 1，25-（OH）2D3 on cell viability of INS-1 cells

表3　1，25-（OH）2D3对STZ致INS-1细胞损伤的胰岛素分泌的影响Table 3 Effects of 1，25-（OH）2D3 on insulin secretion of INS-1 cells damaged by STZ

表4　1， 25-（OH）2D3对STZ致INS-1细胞损伤的细胞活性的影响Table 4 Effects of 1， 25-（OH）2D3 on cell viability of INS-1 cells damaged by STZ

表5　1，25-（OH）2D3对INS-1细胞MDA生成和T-AOC能力的影响Table 5 Effects of 1，25-（OH）2D3 on the production of MDA and capacity of T-AOC of INS-1 cells

3　讨论

维生素D除其传统作用外，越来越多的新功能已被人们认知。缺乏维生素D不仅影响免疫系统，还可以导致胰岛细胞功能紊乱； 重度佝偻病患者体内的胰岛素合成明显减少，表现为明显的胰岛素缺乏症［5］。维生素D在葡萄糖/胰岛素代谢中发挥着重要作用［6］，是维持胰岛结构和功能正常所必不可少的因素［7］， 本实验结果进一步证实了此观点。

氧化应激（oxidative stress）是指机体组织或细胞内氧自由基生成增加或清除能力下降，导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）在体内或细胞内蓄积而引起的氧化损伤过程［8］。ROS会攻击生物膜不饱和脂肪酸形成脂质过氧化物，其产物MDA是一种有害物质，可作为评价脂质过氧化反应强弱的指标［9］； T-AOC是反应组织抗氧化能力的重要指标之一。与其他组织细胞相比，胰岛细胞缺乏抗氧化酶类，易受氧化应激损伤［10，11］，抗氧化能力较弱，对活性氧更加敏感。胰岛细胞损伤和功能异常是糖尿病发生的主要原因。ROS可以损伤胰岛细胞的细胞核和线粒体，导致胰岛素分泌水平下降，细胞凋亡增加［12］。而STZ可以直接产生ROS，被广泛用于制作糖尿病模型［13］。越来越多的研究结果显示，氧化应激与糖尿病及其并发症的发生发展关系密切。本实验结果显示，STZ损伤组的细胞活力和胰岛素分泌都明显受到抑制，同时MDA显著上升，T-AOC明显下降； 与STZ组比较，保护组和修复组的细胞活力和胰岛素分泌水平均上升，细胞活性升高，而MDA水平下降，T-AOC水平上升，结果表明1，25-（OH）2D3能有效的保护和修复STZ引起的胰岛细胞损伤，恢复胰岛细胞的功能，其机制可能是通过抑制脂质过氧化物的生成，提高细胞的总抗氧化能力。

维生素D对于糖尿病的影响机制目前尚未完全阐明，本实验结果表明1，25-（OH）2D3可以在体外试验中提高胰岛细胞的活力、促进胰岛素分泌和改善氧化应激作用，但仍需要更多的动物体内实验和相关的临床研究进行验证。

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Protective and Repairing Effects of 1，25 - dihydroxy Vitamin D3 on STZ induced INS-1 Cells Damage

HE Da-wei， NI Cheng-pei， WANG Yu-bin， WANG Jing， ZHOU Zheng-yu
（Laboratory Animal Center of Soochow University， Suzhou 215123， China）

Objective To explore the protection and repair effects of 1，25-dihydroxyvitamin D3 on STZ-induced INS-1 cells damage. Methods After inoculating the INS-1 cells into the culture plates，the proliferation activity of the cells was measured by CCK8 method. Secreted insulin and malondialdehyde （MDA） concentration， total anti-oxidation capability （T-AOC） in the culture medium were measured by ELISA. Results 1，25-dihydroxyvitamin D3 improved the viability and insulin secretion of the INS-1 cells（P＜0.01）. The cell proliferation （P＜0.001）， insulin secretion （P＜0.01） and T-AOC （P＜0.01） of the STZ group decreased， and the MDA content （P＜0.01） significantly increased Compared with the STZ group， the protection and repairation group of 1，25-dihydroxyvitamin D3 can improve the above index in different degrees（P＜0.01）. Conclusions 1，25-dihydroxy vitamin D3 improved the insulin secretion of the INS-1 cells and had significantly protection and repair effects on the INS-1 cells damaged by STZ.

1，25-dihydroxyvitamin D3； Insulinoma （INS-1） cells； Streptozotocin （STZ）； Insulin

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0458-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.006

2015-03-15

江苏省自然科学基金（BK20151217）

何大伟（1987-）， 男， 苏州大学医学部2012级硕士研究生。E-mail： 645836427@qq.com

周正宇（1973-）， 男， 副教授， 主要从事比较医学研究。E-mail： zacharyzhou@suda.edu.cn