刘学旭， 杨　文， 丁运萍

（四川大学1. 实验动物中心； 2.口腔疾病研究国家重点实验室， 成都610041）

孕中期限饲法建立胎儿宫内生长受限小鼠模型

刘学旭1， 杨文1， 丁运萍2

（四川大学1. 实验动物中心； 2.口腔疾病研究国家重点实验室， 成都610041）

目的 研究孕中期限饲法建立胎儿宫内生长受限（FGR）模型的可行性。方法 将90只（雌性60只，雄性30只）3月龄KM小鼠随机分为对照组，模型I、II、III和IV组，每组雌12只、雄6只，雌雄2∶1合笼。所有孕鼠在妊娠10 d前自由采食， 从妊娠10 d， 模型I、II、III和IV组分别给予对照组相对应孕期80%、70%、60%和50%的日粮， 对照组自由采食。结果 对照组、模型I、II、III和IV组： 妊娠15 d孕鼠体质量分别平均增长26.03 g、21.31 g、19.09 g、16.96 g 和13.19 g， 模型组孕鼠体质量增长均低于对照组（模型II组P＜0.05、模型III组和IV组P＜0.01）； 平均窝重分别是21.12 g、19.20 g、18.95 g、15.59 g和12.99 g， 模型组胎仔平均窝重低于对照组（模型III组P＜0.05、IV组P＜0.01）； 模型I、II、III和IV组FGR发生率分别为42.97%、66.17%、66.38% 和54.26%， 与对照组（4.76%）比较显著增高（P＜0.01）； 模型组新生胎儿脏器平均质量除脑组织、模型IV组的心脏、肝脏外均明显低于对照组（P＜0.05）。结论 孕中期限饲法建立胎儿宫内生长受限动物模型是可行的，其中给予正常孕鼠同期60%～70%的日粮建立FGR模型效果较佳。

胎儿宫内生长受限（FGR）； 限饲法； 动物模型； KM小鼠

胎儿宫内生长受限（fetal growth restriction， FGR）是常见的一种危害胎儿生存质量的妊娠并发症， 其发病率为3%～10%，我国发病率平均为6%［1］。FGR的原因较复杂，胎儿染色体异常、妊娠妇女宫内感染、妊娠妇女营养不良和不良生活习惯等都有可能引起FGR［2］。并且对新生婴儿及其以后的生长发育及免疫功能都均有影响［3］。有研究显示，在FGR儿出生后，其激素水平与对照组有显著差异［4］，然而FGR病因及发病机制至今尚未完全明了，病因多样［5］，因此建立一种良好的FGR动物模型，对FGR的病因、病理、治疗学方面的研究是非常必要的。常见的造模方法有： 外科手术法［6，7］、更生霉素注射法［8］、被动吸烟法［9］、母体营养不良法［10］、饥饿法［12，13］等。以上方法各有利弊，有的胎仔死亡率高，有的实验操作繁琐，有的毒性大，有的FGR发生率低。

总食物的限制是FGR造模的手段之一，但已有报道［8］显示，其日粮控制的时间和量控制比较困难。且不同的低营养水平、不同的限饲时间对FGR的发生也有很大影响［13］。本文以正常孕鼠采食量为标准，模型组在孕中期按比例限制孕鼠的采食量，观察胎儿的发育情况， 证明此方法建立FGR模型是可行的， 方法简单、易于操作， 现报道如下。

1　材料与方法

1.1实验动物

SPF级3月龄KM小鼠90只，雌性60只，雄性30只，由四川大学实验动物中心提供［SCXK（川）2013-026］。饲养在四川大学实验动物中心层流架中，饲养室温度20±1℃，相对湿度50%±25% ［SYXK（川）2013-0185］。

1.2动物日粮

小鼠繁殖颗粒饲料由四川大学实验动物中心提供［SCXK（川）2013-01］，高温高压消毒后使用。

1.3实验方法

1.3.1妊娠及动物分组将3月龄KM小鼠称重，随机分为对照组，模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组，每组雌性12只、雄性6只，按雌雄2∶1合笼（对照组先于模型组合笼，待对照组动物全部检出阴栓后将模型组动物合笼），次日检查阴栓，发现阴栓视为妊娠，单笼饲养并记为妊娠1 d。对照组在孕期全程自由采食，模型组妊娠10 d开始限饲，限饲标准分别为对照组同期日采食量的80%、70%、60%和50%， 至分娩。每日测定孕鼠体质量和采食量， 自由饮水。称取胎儿的体质量， 测定胎儿的体长、尾长和脏器质量。

1.3.2模型判定采用标准差法，以对照组平均出生体质量减去该组标准差的2倍为标准［13］，模型组中出生体质量小于或等于此标准者为FGR，大于此标准者为正常。

1.4统计学处理

2　结果

2.1采食量

妊娠10～19 d，对照组采食量分别为6.27 g、6.87 g、6.88 g、7.44 g、7.53 g、8.23 g、8.59 g、9.50 g、10.13 g和7.51 g， 模型组采食相应比例饲料。

2.2母鼠体质量

妊娠0～10 d，各组孕鼠体质量增长缓慢，增长速率一致。妊娠10 d后， 各组小鼠体质量均呈现快速增长态势， 但增长速率出现差异， 妊娠15 d模型Ⅰ、Ⅱ组、Ⅲ和Ⅳ组平均体质量分别增长21.31 g、19.09 g、16.96 g和13.19 g， 均低于对照组26.03 g，其中模型Ⅲ、Ⅳ组P＜0.01， 模型Ⅱ组P＜0.05， 模型Ⅰ组无显著性差异（P＞0.05），产前（妊娠18 d）模型Ⅰ组、模型Ⅱ组、模型Ⅲ组和模型Ⅳ组平均体质量分别增长31.11 g、26.00 g、23.11 g、17.80 g，均低于对照组37.52 g（模型Ⅰ组P＜0.05，模型Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组P＜0.01）（图1）。

2.3母鼠产仔数和窝重

妊娠母鼠平均窝重随限饲水平升高逐渐降低，与对照组比较，模型Ⅰ组、Ⅱ组P＞0.05， 模型Ⅲ组胎窝重明显低于对照组P＜0.05， 模型Ⅳ组胎窝重最低，与对照组比较P＜0.01。与模型Ⅰ组比较，模型Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组窝重均低于模型Ⅰ组，但模型Ⅱ组和模型Ⅲ组差异不显著（P＞0.05），模型Ⅳ组窝重显著低于模型Ⅰ组（P＜0.01）。与模型Ⅱ组比较，模型Ⅲ组（P＞0.05）和模型Ⅳ组（P＜0.01）窝重低于模型Ⅰ组（表1）。

图1　不同限饲水平妊娠鼠体质量变化

表1　母鼠产仔数和窝重

2.4胎儿体尺

模型组的体长和尾长，除模型Ⅰ组体长外， 均明显低于对照组（P＜0.01）。模型组之间体长和尾长无明显差异（P＞0.05）（表2）。

2.5胎儿脏器质量

限饲组胎儿脏器质量均低于正常采食量组， 除模型组的脑、模型Ⅳ组的心脏、肝脏重量与对照组比较无显著性差异外，其余各组的脏器重量均明显低于正常对照组胎儿脏器的重量（P＜0.05）（表3）。

表2　各组胎仔体尺 cm

2.6FGR发生率

据FGR判定标准， 低于对照组2个标准差（1.57 g）以下者为FGR胎鼠。模型Ⅱ、Ⅲ组FGR发生率显著高于模型Ⅰ组（P＜0.01）； 模型Ⅳ组高于模型Ⅰ组，模型Ⅱ、Ⅲ组略高于模型Ⅳ组， 但差异均无显著性（P＞0.05）（表4）。

3　讨论

FGR也称为胎儿宫内生长迟缓（intra-uterine growth retardation，IUGR）。建立FGR动物模型对于深入研究FGR发生的机制，疾病发生过程及病理改变具有重要作用［13］。目前常见的造模方法中，子宫动脉结扎法虽然使用频率较高，但手术对对照组母体和胎儿的影响大，对照组的出生体质量相对较轻； 更生霉素是一种细胞毒性药物， 其毒副作用影响该种模型的广泛应用［14］； 吸烟法操作较繁琐，吸烟的量和时问不好掌握，而且流产率、畸形率和死胎率较高，香烟中的尼古丁等有害成分对FGR的发生是否有影响还不十分明确［8］； 母体营养不良法对饲料合成技术要求高。本研究采用孕中期限饲法复制FGR动物模型与临床上营养不良型FGR相似，并对母体营养不良法建立FGR模型作了改进。

表3　各组胎儿脏器重量 mg

表4　小鼠FGR发生情况

3.1模型特点

本研究选用小鼠孕中期限饲法建立FGR模型，与传统的建模方法比较有如下特点： 1）无需手术，避免外科手术对对照组胎儿的影响。2）不使用药物， 避免药物的毒副作用对模型的影响。3）克服了被动吸烟法产生多种毒性物质对模型的影响。4）对母体营养不良法特别是总食物的限制建立模型，提出了明确的限饲时间、限饲方法和限制量。限饲时间为小鼠妊娠中期，怀孕10 d开始到分娩； 限饲方法为每日以对照组正常采食量为标准，按比例提供模型组相应孕期的采食量； 限制量为正常孕鼠同期采食量的80%、70%、60%和50%。5）在FGR病因中，患儿按细胞水平可分为发育不全型和营养不良型。营养不良型多见于胎盘功能不全、多胎、过期妊娠、妊娠高血压综合征等［15］，本方法建立FGR模型符合临床上营养不良型FGR的特点，可用于研究营养不良型病因引起的FGR发病机制，以及母体新陈代谢改变引起FGR的分子机制及FGR与新生儿肥胖症的关系等。

3.2模型方法的改进

孕中期限饲法建立FGR模型，属于母体营养不良法建立FGR模型范畴，传统的母体营养不良法， 不管是采用低蛋白饮食法，还是采用低能量饮食都需要配制2种以上饲料［16，17］，对饲料合成技术要求高，本方法对照组和各模型组使用同一种饲料，不需要另外配制模型组饲料，简便、易行。

本研究采用在妊娠中期限制模型组小鼠的采食量，分别给予对照组正常采食量的80%、70%、60%和50%的日粮一直维持到胎儿出生， 并获得发生率为42.97%、66.17%、66.38%和54.26%的FGR模型，解决了传统母体营养不良法在日粮控制时间和控制量上的困难，且模型发生率较高。

3.3模型制备注意事项

获得模型组孕期饲料供给量，是本实验成败的关键。因此只要对照组动物的孕期提前模型组动物1d，就能提前获得对照组孕期动物正常采食量，从而获得模型组动物饲料供给量。研究表明：限饲水平下降到母鼠正常采食量的50%时， FGR发生率反而会降低，同时伴随窝产仔数的降低，可能是母体以胎仔数减少来对抗营养供给不足的结果，提示采用此方法建模时，限饲量不宜太低。

综上所述，从小鼠妊娠中期限制采食量建立FGR模型是可行的，给予同期正常孕鼠60%～70%的日粮至分娩，可获得66.17%～66.38%的FGR模型，造模方法操作简单易行。

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Mouse Model for Fetal Growth Restriction in Pregnant Metaphase by Limited Feeding

LIU Xue-xu1， YANG Wen1， DING Yun-ping2
（1. Laboratory Animal Center of Sichuan University， Chengdu 610041， China；2. State Key Laboratory of Oral Diseases， Chengdu 610041， China）

Objective To established the fetal growth restriction （FGR） mouse model in pregnant metaphase by limited feeding. Methods Ninety KM mice （60 females and 30 males， 3 months old） were divided randomly into 5 groups consisting of the control， model I， II， III and IV group. Mice in each group （12 female and 6 male） were placed in the mating cage with one male and 2 females. All the pregnant mice were fed ad libitum before day 10 of pregnancy. After that， model I， II， III and IV group were fed with 80%， 70%， 60% and 50% of daily ration respectively according to control group feeding ad libitum. Results The average weight increment in 15-day pregnancy mice was 26.03 g， 21.31 g，19.09 g， 16.96 g and 13.19 g in control， model I， II， III and IV group， respectively. The weight increment in model group was significantly higher than that of control group （model II group P＜0.05， III group and IV group P＜0.01）； The average litter weight was 21.12 g， 19.20 g， 18.95 g， 15.59 g and 12.99 g in control， model I， II， III and IV group， respectively. The litter weight in model group was significantly lower than that of control group （model III group P＜0.05， IV group P＜0.01）； The incidence of FGR in model I， II， III， IV and control group was 42.97%、66.17%、66.38%、54.26% and 4.76%，respectively. The incidence in all model groups was significantly higher than that in control group （P＜0.01）. Except for the brain tissue in all model groups as well as the heart and liver tissue in model IV group， all the fetal organ weight in model group was significantly lower than that in control group （P＜0.05）. Conclusion It is feasible to establish the FGR model in pregnant metaphase by limited feeding. The best FGR model may be obtained by feeding the pregnant mice at 70% to 60% of daily ration of normal pregnant mice.

Fetal growth restriction （FGR）； Limited feeding； Animal model； KM mice

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0453-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.005

2015-04-22

刘学旭（1964-）， 男， 高级实验师， 研究方向： 动物实验方法。E-mail： liu_xx@126.com

丁运萍（1965-）， 女， 高级实验师， 研究方向： 动物实验方法。E-mail： 1589492339@qq.com