鲍悦，孙尚志，孙佳明，张辉*

(1.长春中医药大学 中医药与生物工程研发中心，吉林 长春 130117；2.拜泰齐贸易(上海)有限公司，上海 201203)

·中药工业·

陶瓷膜过滤在分离提取中国林蛙皮中透明质酸的应用研究△

鲍悦1，孙尚志2，孙佳明1，张辉1*

(1.长春中医药大学 中医药与生物工程研发中心，吉林 长春 130117；2.拜泰齐贸易(上海)有限公司，上海 201203)

目的：研究陶瓷膜过滤技术对中国林蛙皮中透明质酸(HA)的纯化工艺。方法：以膜通量或截留率为指标，运用单因素试验优选中国林蛙皮中HA的陶瓷膜纯化工艺参数。结果：陶瓷膜最佳的分离纯化条件为孔径500 nm，操作压力0.1 MPa，滤过25 min，HA截留率91.67%；HA中葡萄糖醛酸质量分数为36.68%，蛋白质质量分数为0.58%，该纯度已达到化妆品级别。结论：该陶瓷膜过滤工艺适用于纯化中国林蛙皮中的HA，对中国林蛙的产业化起到一定的促进作用。

陶瓷膜过滤；中国林蛙皮；透明质酸

透明质酸(HA)是一种高分子量的直链多糖，早在1934年Meyer和Palmer[1]首次从牛眼的玻璃体组织中分离出玻璃酸及其钠盐，命名为HA。HA是一种重要的医药用原料，同时也是理想的保湿剂和良好的透皮吸收促进剂，并且还是理想的天然保湿因子。二十几年来，国内外学者对其理化性质，生理功能以及应用[2-12]进行了较为全面，系统的研究。

在前人对HA以及陶瓷膜过滤技术的研究[13-16]基础上，改进HA的陶瓷膜过滤工艺，以陶瓷膜过滤方法替代了传统的有机溶剂法来去除中国林蛙皮提取物中的蛋白。吉林省的中国林蛙资源较为丰富，将优化后的膜分离工艺应用于中国林蛙皮中HA的分离纯化，使其纯度达到化妆品级别，能为林蛙整个行业的发展带来较为可观的经济效益。

1 仪器与材料

1.1 仪器

低速大容量多管离心机，低温超速离心机，KQ-100型超声波清洗器，陶瓷膜过滤设备，DZF-6050型真空干燥箱，PHS-2C型精密酸度计，紫外可见分光光度计(Cary 50 UV-Vis)等。

1.2 材料

胃蛋白酶(1∶3000)(中国惠世化学试剂有限公司)，三氯醋酸(沈阳市新西试剂厂)，高岭土(广东省汕头市西陇化工厂)，氯化钠、95%乙醇、无水乙醇(北京化工厂)，盐酸(天津市大茂化学试剂厂)。

中国林蛙皮，源自吉林省辉南县的野生健康林蛙，经长春中医药大学张辉教授鉴定为林蛙Ranatemporariachensinensis的皮。

2 方法与结果

2.1 HA的提取

选择取油后的中国林蛙皮，粉碎，加10倍量水浸泡24 h，以12 000 r·min-1的转速匀浆3 min，匀浆后成糊状，搅拌加热至90 ℃，保温10 min，冷却至50 ℃，自溶12 h，4000 r·min-1离心除去残渣，残渣用4倍量水洗涤两次，得HA粗提取液。

2.2 HA的陶瓷膜过滤

2.2.1 截留率的测定 精密称取葡糖醛酸(AR)20 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解至刻度，摇匀备用。按照葡糖醛酸含量测定方法，在530 nm处测定吸光度，以吸光度对质量浓度作图，绘制葡糖醛酸含量的标准曲线，得回归方程：Y=0.012X-0.002 7，r=0.999 2。

取上述HA粗提取液4000 mL，在操作压力为0.1 MPa，以孔径500 nm、比表面积0.5 m2进行滤过25 min。取滤过前的原液和截留液按照上述标准曲线的方法进行葡糖醛酸含量的测定，得出相应的质量浓度分别为C1和C2，按公式计算得出相应的截留率。

截留率(%)=(1-C2/C1)×100%

(1)

2.2.2 膜孔径的确定 取上述HA粗提取液4000 mL，用浓盐酸调pH值为2.0，在操作压力为0.1 MPa，以孔径500 nm和孔径100 nm两种规格的陶瓷膜，比表面积0.5 m2分别进行滤过25 min，按照上述截留率的测定方法进行测定，以陶瓷膜对HA的截留率为考察指标，考察两种规格的陶瓷膜在截留HA的差异，结果截留率分别为91.67%、93.85%。

2.2.3 操作压力对膜通量的影响 取上述HA粗提取液4000 mL，用浓盐酸调pH值为2.0，以孔径500 nm、比表面积0.5 m2进行滤过25 min，考察陶瓷膜工作过程中膜通量(mL·cm-2·h-1)随压力的变化，结果见图1。

图1 操作压力对中国林蛙HA膜通量的影响

2.2.4 膜通量随时间的变化 取上述HA粗提取液4000 mL，用浓盐酸调pH值为2.0，在操作压力为0.1 MPa，以孔径500 nm、比表面积0.5 m2进行滤过，考察陶瓷膜工作过程中膜通量(mL·cm-2·h-1)随时间的变化，结果见图2。

图2 时间对中国林蛙膜通量的影响

2.2.5 HA的陶瓷膜过滤最佳工艺 取上述HA粗提取液4000 mL，用浓盐酸调pH值为2.0，在0.1 MPa陶瓷膜操作压力下，以孔径500 nm、比表面积0.5 m2进行滤过25 min，截留液干燥得HA精制品。

2.3 HA的纯化

对上述经过陶瓷膜过滤得到的HA精制品进一步纯化，按照1∶30的比例加入水，同时加入溶液体积3%的高岭土50 ℃加热30 min，离心，少许水洗涤残渣，离心，水液合并，放冷至0～4 ℃，加入三氯醋酸饱和溶液，使溶液中三氯醋酸浓度达到8%，静置30 min后，离心，取上清液加入氯化钠使溶液中氯化钠的质量分数为2.93%，加入3倍量的95%乙醇，静置24 h，抽滤，依次用95%乙醇、无水乙醇洗涤产品，重复醇沉1次，得到HA纯品[17]。

2.4 HA的纯度测定

2.4.1 HA中葡糖醛酸含量测定 目前国内外一般以葡糖醛酸含量表示HA的纯度，根据HA的结构计算，每100 mg透明质酸钠纯品完全水解后可产生葡萄糖醛酸48.38 mg、氨基葡萄糖44.65 mg[18]。精密称取HA纯品100 mg置100 mL的容量瓶中，加双蒸水定容，取该溶液1 mL，按照2.2.1项下的方法测定，经计算得样品中的葡萄糖醛酸质量分数为36.68%。

2.4.2 HA中蛋白质含量测定 精密称取牛血清蛋白(BSA)25 mg，置于100 mL量瓶中，用0.15 mo1·L-1氯化钠溶液定容至刻度，配制成质量浓度为0.25 mg· mL-1的蛋白溶液[19]。按照考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的方法，以BSA微克数对吸光度作图，得标准曲线为Y=0.001 8X+0.010 5，r=0.992 9。精密称取HA纯品500 mg，按照标准曲线的方法进行测定，从标准曲线得到蛋白质的质量，以此计算HA纯品中蛋白质质量分数为0.58%。

3 讨论

孔径500 nm截留分子量100万道尔顿和孔径100 nm截留分子量30万道尔顿这两种规格的陶瓷膜，在HA的截留率上没有较大的差别，基于尽量除去蛋白质等杂质的同时减少耗能的原则，所以选择孔径500 nm的陶瓷膜；陶瓷膜在一定压力范围内，膜通量与压力差呈正比，但随着压力差增大到一定程度，膜通量反而有减小的趋势。压力应控制在0.1～0.15 MPa较为适宜，由于压力在0.1 MPa的时候，膜通量基本达到峰值，压力为0.15 MPa时的膜通量较压力为0.1 MPa时的膜通量并没有较大的增长，并且同时增加了设备的负荷和耗能，故压力选择0.1 MPa；HA通过陶瓷膜的膜通量随时间延长而衰减，经过一定时间后，达到稳定状态，膜通量基本保持不变。从膜在单位压力下的自来水通量(5.7 mL·cm-2·h-1)与过滤25 min时的膜通量(2.23 mL·cm-2·h-1)相比，可知膜通量在25 min左右降低了60%左右，因此滤过时间确定为25 min。

在应用陶瓷膜滤过分离HA时，当pH调到1.7～3.3时，HA易发生可逆的交联反应，增大了分子直径，可以有效提高HA的截留率，因此采用浓盐酸调pH值为2.0。据文献报道应用于化妆品级别的HA的平均分子量在300万道尔顿左右[20]，在应用陶瓷膜过滤工艺时，大部分蛋白质可以透过陶瓷膜，但仍有一部分蛋白质因其分子量大于100万道尔顿而与HA一同被截留下来，故采用三氯醋酸对陶瓷膜滤过得到的HA精制品进行进一步的纯化，提高其纯度。

将优化后陶瓷膜分离工艺应用于中国林蛙皮中HA的分离，使得每千克林蛙皮可收到2.8 g HA纯品，对其中HA进行含量测定，其葡萄糖醛酸质量分数为36.68%。由于化妆品级HA含葡萄糖醛酸为35%～45%，医药级HA含葡萄糖醛酸量为42%～48%，因此应用陶瓷膜过滤纯化得到的中国林蛙皮HA已达到化妆品级别。另经测定纯化后的HA中蛋白质质量分数为0.58%，可知其中的蛋白质含量很低，故陶瓷膜过滤在分离提取中国林蛙皮中HA有着较好的效果。陶瓷膜过滤分离技术将对中国林蛙皮中HA的规范化和标准化生产起到一定的促进作用。

[1] Meyer K，Palmer JW.The polysaccharide of the vitreous humor [J].J Biol Chem，1934，107：629-634.

[2] Torvard C，Laurent J，Robert E，et al.The properties and turnover of hyaluronan[J].Ciba Foundation symposium，1986，124：9-29.

[3] 永井昌义.化妆料：日本，JP62-158203[P].1987-05-20.

[4] 徐红，陆志华.透明质酸钠在化妆品中的应用[J].中国生化药物杂志，1998，19(5)：222-223.

[5] 侯骏骥，张天民，牛桂珍.玻璃酸钠在妇产科领域的应用[J].中国生化药物杂志，2003，24(5)：262-264.

[6] 陈鹏.葡聚糖接枝透明质酸共聚物作为皮肤敷料的研究[D].广州：暨南大学，2013.

[7] 王娟勤.透明质酸的改性及功能化[D].无锡：江南大学，2013.

[8] 孙秀娟，范代娣，朱晨辉，等.类人胶原蛋白-透明质酸血管支架的性能及生物相容性[J].生物工程学报，2009，25(4)：591-598.

[9] 李棋，唐新，裴福兴，等.透明质酸在骨关节疾病中的应用[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(47)：8835-8839.

[10] 吴溯帆，石杭燕，严晟，陈等.透明质酸在面部美容中的应用[J].中国美容整形外科杂志，2007，18(5)：324-328.

[11] van Reis R，Zydney A.Membrane separations in biotechnology[J].Current opinion in biotechnology，2001，12(2)：208-211.

[12] Harris ELV，Angal S.Protein purification applications：a practical approach[M].IRL：OXFORD，UK，1989.

[13] 何江川，韩永萍.超滤膜分离法在多糖分离提取中的应用[J].食用菌，2005，27(1)：5-7.

[14] 范益群，漆虹，徐南平.多孔陶瓷膜制备技术研究进展[J].化工学报，2013，64(1)：107-115.

[15] 路钊，吴克宏，丁志斌，等.陶瓷膜强化过滤技术的应用[J].净水技术，2012，31(6)：14-17.

[16] Lowry OH，Rosebrough NJ，Farr AL，et al.Protein measurement with the Folin pHenol reagent.J Biol Chem，1951，193：265-275.

[17] 沈渤江，张天民.公鸡冠透明质酸的制备及其理化性质[J].中国医药工业杂志，1986，17(7)：3-6.

[18] Bitter T，Muir HM.A modified uronid uronic acid carbazole reaction.[J].AnalBiochem，1962，4(4)：330-333.

[19] Laemmli U.K.Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of BacteriopHage T.4.Nature，1970，227(259)：680.

[20] 徐红，陆志华.透明质酸钠在化妆品中的应用[J].中国生化药物杂志，1998，19(5)：222-223.

ApplicationofCeramicMembraneFiltrationinExtractionofHyaluronicAcidfromSkinofRanatemporariachensinensis

BAOYue1，SUNShangzhi2，SUNJiaming1，ZHANGHui1*

(1.ChangchunUniversityofTraditionalChineseMedicine，TraditionalChinesemedicineandbiologicalengineeringresearchanddevelopmentcenter，Changchun130117，China；2.BiotageTrading(Shanghai)Co.，Ltd.，Shanghai201203，China)

Objective：To purify hyaluronic acid (HA) from the skin ofRanatemporariachensinensisby ceramic membrane filtration.Methods：Using membrane flux or rejection as the index，the purification process parameters of HA in the skin was optimized by single factor experiments.Results：Best of ceramic membrane separation and purification conditions：pore size of 500 nm，operating pressure of 0.1 MPa，filtration 25 min，HA retention rate of 91.67%.Glucuronic acid in HA content of 36.68%，0.58% protein content，the purity has reached the cosmetic grade.Conclusion：The ceramic membrane filtration process is suitable for the purification of HA in the skin of Chinese forest frog，it can promote the industrial utilization ofR.temporariachensinensis.

Ceramic membrane filtration；the skin ofRanatemporariachensinensis；hyaluronic acid

2015-04-10)

国家中医药行业专项(2015468002-2)

*

张辉，教授，博士生导师，研究方向：中药化学成分与应用开发；E-mail：Zhanghui_8080@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.016