高俊丽，邵艳华，李倩，章润菁，丁平

(广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006)

·基础研究·

广陈皮及其近缘种药用植物的HPTLC研究

高俊丽，邵艳华，李倩，章润菁，丁平*

(广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006)

目的：建立广陈皮挥发油和黄酮类成分高效薄层色谱指纹图谱，并以广陈皮为基础对不同产地的陈皮及柑橘属常用药用植物进行分析。方法：应用硅胶GF254高效预制薄层板，挥发油成分以石油醚-三氯甲烷(2∶8.5)为展开剂展开，喷以5%的香草醛硫酸溶液，105 ℃加热至斑点清晰，日光下观察；黄酮类成分以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(10∶1.7∶1∶0.5)和甲苯-乙酸乙酯(5∶5)为展开剂，二次展开，喷以5%三氯化铝乙醇液，置于365 nm下检视。将显色后的薄层色谱图导入CHROMA P1.5色谱指纹图谱系统解决方案软件生成共有模式，进行测试分析。结果：广陈皮挥发油成分和黄酮类成分薄层色谱指纹图谱分别由9个色谱峰组成，柑橘属常用药用植物之间在两种成分上存在较大差异。结论：该方法可以快速、有效地对广陈皮及其同属药用植物进行鉴定和质量评价。

广陈皮；柑橘属；挥发油；黄酮；高效薄层色谱指纹图谱

陈皮是芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮[1]，药材分为“陈皮”和“广陈皮”，其中以广陈皮的质量为优。广陈皮正品来源为茶枝柑Citrusreticulata‘Chachi’的皮，主产于广东新会[2]。陈皮具理气健脾、燥湿化痰的功能，用于脘腹胀满、食少吐泻、咳嗽痰多[3]。广陈皮的有效成分为挥发油和黄酮类，研究报道，黄酮类以橙皮苷含量最高，其次为川陈皮素和橘皮素[4]。市场上一直存在陈皮与广陈皮代用的状况，为了正确评价广陈皮的质量，本研究建立了广陈皮挥发油成分和黄酮类成分高效薄层色谱指纹图谱，以采自广东省新会的陈皮为对照药材，建立薄层色谱指纹图谱共有模式，考察了不同来源广陈皮指纹图谱的特征；并对广陈皮近缘种常用药用植物进行研究，为广陈皮及其近缘种药用植物的鉴定和质量评价提供简便、有效的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂

硅胶GF254高效预制薄层板(Merck)，SP-20E型全自动点样仪(上海科哲生化科技有限公司)，双槽层析缸，HWS24型电热恒温水浴锅，TH-Ⅱ型薄层加热器(上海科哲生化科技有限公司)，WFH-201B紫外透射反射仪(上海精科实业有限公司)，IX-US50型数码相机(Canon公司)，CHROMA P1.5色谱指纹图谱系统解决方案软件( 珠海科曼中药研究有限公司)。试剂均为分析纯。

1.2 对照品

月桂烯、橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素、橘皮素(上海源叶生物科技有限公司)，纯度均大于98%。

1.3 样品

药材收集于广东、四川、浙江等省，经广州中医药大学丁平研究员鉴定其种类，详见表1，凭证存放于广州中医药大学中药资源教研室。

表1 陈皮及近源种药材来源信息表

2 方法

2.1 对照品溶液的制备

取月桂烯用甲醇按1∶10的比例稀释；精密称取橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素、橘皮素，分别加甲醇配制成1 mg·mL-1的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 挥发油供试品的制备 按照《中华人民共和国药典》(2010年版)一部附录XD的方法提取，取广陈皮及其近缘种药材粗粉约30 g，加水300 mL，浸渍30 min，微沸4 h得挥发油。挥发油经无水硫酸钠干燥后，用甲醇按1∶10的比例定容，即得。

2.2.2 黄酮类供试品的制备 称取粉末约2 g，加石油醚100 mL，于85 ℃用索氏提取器提3 h；药渣挥干，加80%乙醇100 mL，85 ℃回流3 h，过滤，挥干滤液，加甲醇定容至25 mL，即得。

2.3 薄层色谱条件

2.3.1 挥发油成分 精密取2.1项制备的月桂烯对照品溶液1 μL和2.2.1项制备的供试品溶液6 μL点于硅胶GF254高效预制薄层板上，条带宽7 mm，点样速度5 μL·min-1，以石油醚-三氯甲烷(2∶8.5)为展开剂，在25 ℃左右，相对湿度47%条件下展开，展距8 cm，取出，挥干溶剂，喷以5%的香草醛硫酸溶液，105 ℃加热至斑点清晰，日光下观察。

2.3.2 黄酮成分 精密取2.1项制备的橙皮苷、橘皮素、川陈皮素对照品溶液5、5、1 μL和2.2.2项制备的广陈皮对照药材和不同商品来源广陈皮供试品溶液5 μL点于硅胶GF254高效预制薄层板上；精密取2.1项制备的橙皮苷、柚皮苷、橘皮素、川陈皮素对照品溶液各5、5、5、1 μL和2.2.2项制备的广陈皮对照药材及近缘种药材供试品溶液各5 μL，点于硅胶GF254高效预制薄层板上。在25 ℃左右环境下，以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(10∶1.7∶1∶0.5)展开约4 cm，取出晾干，再以甲苯-乙酸乙酯(5∶5)展开8 cm，取出晾干，喷以5%三氯化铝乙醇液，用热风微吹，置于365 nm下检视。

2.4 薄层色谱指纹图谱的测定

广陈皮薄层色谱指纹图谱见图1、图3，同属常用药用植物薄层色谱指纹图谱见图2、图4。挥发油成分对照品的Rf值：月桂烯(Rf≈0.9)；黄酮成分对照品的Rf值分别为：橙皮苷(Rf≈0.2)、柚皮苷(Rf≈0.2)、川陈皮素(Rf≈0.58)、橘皮素(Rf≈0.63)。

注：S.月桂烯对照品；1.广陈皮对照药材；2～10.不同批次的商品广陈皮。图1 不同商品来源广陈皮挥发油成分薄层色谱指纹图谱

注：S.月桂烯对照品；1.广陈皮对照药材；11.川陈皮；12.浙江陈皮；13.江西陈皮；14.安徽陈皮；15.青皮；16.四川枳壳；17.毛橘红；18.香橼；19.广佛手；20.柠檬。图2 广陈皮及其近缘种药用植物挥发油成分薄层色谱指纹图谱

注：S.对照品(a：橘皮素、b：川陈皮素、c：橙皮苷)；1.广陈皮对照药材；2～10.不同商品来源广陈皮。 图3 不同商品来源广陈皮黄酮成分薄层色谱指纹图谱

注：S.对照品(a：橘皮素、b：川陈皮素、c：橙皮苷、d：柚皮苷)；1.广陈皮对照药材；11.川陈皮；12.浙江陈皮；13.江西陈皮；14.安徽陈皮；15.青皮；16.四川枳壳；17.毛橘红；18.香橼；19.广佛手；20.柠檬。图4 广陈皮及其近缘种药用植物黄酮成分薄层色谱指纹图谱

2.5 广陈皮指纹图谱共有模式的建立

将显色后的薄层色谱图导入CHROMA P1.5色谱指纹图谱系统解决方案软件，对挥发油成分和黄酮类成分分别进行白光和紫外扫描并积分。将广陈皮对照药材(1号样品)数据采用中位数法确定特征峰，挥发油成分共指认9个特征峰，其中9号峰为月桂烯，共同构成广陈皮挥发油薄层色谱指纹图谱共有模式(见图5)；黄酮类成分共指认9个峰，其中3号峰为橙皮苷，7号峰为川陈皮素，8号峰为橘皮素，共同构成广陈皮黄酮类成分薄层色谱指纹图谱共有模式(见图6)。

图5 广陈皮挥发油成分指纹图谱共有模式

图6 广陈皮黄酮类成分指纹图谱共有模式

3 结果

3.1 薄层色谱指纹图谱方法学考察

3.1.1 稳定性考察 取同一批次的供试品溶液，分别于0、6、12、24、48 h点样，色谱结果基本一致，比较色谱斑点Rf值，挥发油成分主要色谱斑点Rf值的RSD在0.91%～3.24%，黄酮类成分主要色谱斑点Rf值的RSD在1.76～2.68%，表明供试品溶液在48 h内均稳定。

3.1.2 仪器精密度考察 取同一批次的供试品溶液，在同块薄层板上连续点样5次，色谱结果基本一致，比较色谱斑点的Rf值，主要色谱斑点Rf值的RSD在0.71%～3.93%。

3.1.3 重复性考察 取同一批次的药材样品5份，按2.2项制备供试品溶液，色谱结果基本一致，比较色谱斑点的Rf值，挥发油成分主要色谱斑点Rf值的RSD在0.59%～4.09%，黄酮类成分主要色谱斑点Rf值的RSD在1.25～3.21%，表明建立的方法有良好的重复性。

3.2 广陈皮薄层色谱指纹图谱共有模式的建立

广陈皮挥发油成分薄层色谱指纹图谱共有模式有9个峰组成，其中9号峰为月桂烯；黄酮类成分共有模式有9个峰组成，3号峰为橙皮苷、7号峰为川陈皮素，8号峰为橘皮素，可用于广陈皮的鉴定。

3.3 不同商品来源广陈皮高效薄层指纹图谱的比较

将9批广陈皮薄层色谱指纹图谱数据与广陈皮对照药材相比，挥发油成分相似度均大于0.75，2、3、4、7、8号样品相似度大于0.9，9、10号样品相似度低于0.8；黄酮类成分相似度分散在0.5～0.95，2、3、4号样品相似度大于0.9。说明市售广陈皮质量存在一定差异。见图7、8。

图7 不同商品来源广陈皮挥发油成分相似度比较

图8 不同商品来源广陈皮黄酮成分相似度比较

3.4 广陈皮近缘种药用植物指纹图谱的测定与评价

比较不同产地陈皮及常用柑橘属药用植物和广陈皮对照药材薄层色谱指纹图谱数据的差异，挥发油成分中浙江、江西、安徽陈皮和毛橘红与对照药材相似度在0.9以上，川陈皮、枳壳、香橼、广佛手与对照药材相似度在0.75～0.9，青皮和柠檬相似度0.5左右；黄酮类成分中，佛手和柠檬与对照药材相差最远，其余近缘种药用植物相似度在0.4～0.7。这说明柑橘属常用药用植物不同化学成分间存在较大差异。见图9、10。

3.5 广陈皮及其近缘种药用植物聚类分析

对不同产地的陈皮及柑橘属常用药用植物采用聚类分析法进行分析，见图11、12。从挥发油和黄酮类两种成分的聚类树状图中可以看出，广陈皮与其近缘种药用植物相差较大；浙江、安徽、江西陈皮可大致归为一类；川陈皮的挥发油成分可以和枳壳归为一类，而与青皮相差较远，其黄酮类成分可以和青皮归为一类，而与枳壳相差甚远。柑橘属药用植物存在较大差异，均分为不同的类。

图9 陈皮及常用柑橘属药用植物挥发油成分相似度比较

图10 陈皮及常用柑橘属药用植物黄酮成分相似度比较

图11 陈皮及常用柑橘属药用植物挥发油聚类树状图

图12 陈皮及常用柑橘属药用植物黄酮聚类树状图

4 讨论

广陈皮主要有效成分为挥发油和黄酮类。本实验所用展开剂经过筛选，最终广陈皮挥发油成分采用石油醚—三氯甲烷(2∶8.5)展开系统，在薄层色谱图上得到丰富且分离度好的斑点，此条件也适合同属药用植物。广陈皮黄酮类成分极性相差较大，不易分离，采用乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(10∶1.7∶1∶0.5)和甲苯-乙酸乙酯(5∶5)二次展开系统，可以很好地将黄酮类主要成分分离，应用于同属药用植物中分离效果较理想。与文献[5-8]中使用的广陈皮薄层色谱条件相比较，本研究建立的色谱条件下的图谱斑点丰富、清晰、重现性好。由于橙皮苷和柚皮苷极性极其相近，本实验条件下此两种成分Rf相近导致斑点有重叠。

本研究发现不同商品来源的广陈皮质量存在一定差异，其中黄酮类成分差异性较挥发性成分大。2～8号样品为生药材，其挥发油成分与对照药材的相似度在0.85以上，9、10号为炮制品，其相似度在0.75～0.8。文献报道[9-10]陈皮炮制后挥发油的含量和成分都有所下降，而本研究中炮制品的斑点较对照药材斑点丰富，这是炮制过程还是炮制所用生药材不同导致的，有待进一步研究。不同商品来源的广陈皮黄酮类成分的比较，2、3、4号样品与对照药材的相似度大于0.9，而5～10号样品相似度较低，介于0.5～0.9，有研究报道采收时间和产地是影响广陈皮药材质量的重要因素，特别是川陈皮素和橘皮素的含量受这两个因素的影响较大[11]，这也可能是导致不同商品来源广陈皮黄酮类成分间差异较大的原因。本实验还发现，2、3、4号样品挥发油成分相似度在0.9以上，其性状均为三瓣，并且在挥发油提取过程中发现，完整瓣状广陈皮较丝状广陈皮总挥发油的量更多，提取时间更短，而市售药材多为丝状，建议陈皮药材在加工时不要切丝。文献报道贮存时间越长则陈皮中挥发油的含量逐渐降低，橙皮苷的含量逐渐增多，不同的炮制方法对陈皮化学成分的影响也不同[12]。因此，从产地、采收、加工、贮存等方面严格控制对提高广陈皮的质量有重要意义。

从分析结果看，广陈皮不可与同属药用植物归为一类，浙江、安徽、江西陈皮可大致归为一类，川陈皮和四川枳壳在某些成分上可归为一类，这些归类与按地理区域划分相吻合。市场上常存在同属一些药用植物代用、混用的状况，陈皮代替广陈皮入药更是常见。本研究中虽然发现浙江、安徽、江西陈皮和广陈皮的挥发性成分相似，但其黄酮类成分相差较远，这必将导致疗效的差异，建议不要用陈皮代替广陈皮入药；川陈皮与广陈皮挥发性成分相似度在0.85左右，黄酮类成分相似度在0.6以下，说明两者的有效成分存在较大的的差异，依靠薄层色谱指纹图谱可以将两者区分开。香橼原植物为香橼和枸橼，佛手为枸橼的变种，在广东临床上常以佛手代替枸橼[13]，从实验结果可以看出药材佛手和香橼的化学成分存在较大差异，因此佛手不可代替香橼入药。本研究方法可快速、准确地鉴别陈皮及其近缘种常用药用植物。

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HPTLCFingerprintAnalysisofCitrusreticulata‘Chachi’andItsRelatedSpecies

GAOJunli，SHAOYanhua，LIQian，ZHANGRunjing，DINGPing*

(CollegeofChineseMateriaMedica，GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510006，China)

Objective：To establish the high-performance thin layer chromatographic (HPTLC) fingerprints of volatile oil and flavonoids inCitrus.reticulata‘Chachi’，and compare fingerprints similarity with its related species，such asC.reticulataBlanco from various habitats，etc.Methods：The separation was performed on the pre-coated HPTLC GF254silica-gel plate.The volatile oil was developed with solvent system of petroleum ether-chloroform (2∶8.5)，5% vanillic aldyhyde and oil of vitriol reagent as color development reagent.The flavonoids compounds used second outspread system that ethyl acetate-methanol-water-formic acid (10∶1.7∶1∶0.5) as the first system and toluene-ethyl acetate (5∶5) as the second，and 5% aluminium chloride ethanol solution as color development reagent which needed to be observed in 365 nm.The common patterns of HPTLC fingerprints were obtained through (CHROMAP1.5) solution software，and authentication and quality assessment were analyzed by similarity and Principle Component Analysis.Results：The common patterns of the volatile oil and the flavonoids consisted of 9 characteristic peaks respectively，in these two compounds，there were significant differences among the fingerprints ofCitruscommonly used medicines.Conclusion：This method is simple and rapid，which can serve as an effective identification and quality assessment method forC.reticulata‘Chachi’ and its related species.

Citrus.reticulata‘Chachi’；volatile oil；flavonoids；thin-layer chromatography

2015-01-23)

*

丁平，研究员，研究方向：中药资源有效成分及其质量评价；E-mail：dingpinggz@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.006