李跃辉，王银，袁清照，张水寒

(湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410006)

·中药工业·

Box-Behnken效应面法优选晕瘫通脑片提取工艺△

李跃辉，王银，袁清照，张水寒*

(湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410006)

目的：优选晕瘫通脑片的提取工艺。方法：以葛根素提取量和浸膏得率的综合评分为评价指标，在单因素试验基础上，通过Box-Behnken效应面法考察浸泡时间、加水量、提取时间对提取工艺的影响。结果：优选得到晕瘫通脑片的最佳提取工艺为加水8.6倍量，浸泡63.8 min后提取128.4 min，提取两次。结论：通过Box-Behnken效应面法及总评“归一值”(OD)为评价系统优选的提取工艺稳定、简便易行、预测性好，可为晕瘫通脑片的工艺研究提供参考。

晕瘫通脑片；Box-Behnken效应面法；总评“归一值”；葛根素；浸膏得率

晕瘫通脑片是由三七、丹参、葛根、天麻、地龙等7味中药组成的临床经验方，具有活血化瘀，疏通脑脉，平肝熄风的功能。临床用于瘀阻脑络兼肝风内动证，症见偏瘫、麻木、头晕、头痛、舌质紫暗、脉细弦、脑动脉硬化、中风先兆、脑缺血、脑血栓等。原方以汤剂入药，存在服用量大、易霉变、携带储存不便等缺点[1]，现拟将三七、丹参、全蝎超微粉碎成细粉，与葛根等余下4味药的水提干膏粉混合后制成片剂。本课题采用Box-Behnken效应面法对晕瘫通脑片的提取工艺进行优选，以期达到最优化，并为探讨该法应用于优化中药水提取工艺的可行性提供参考。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT高效液相色谱仪(SPD-20A检测器、LC-20A泵、LC-20B泵)；依利特色谱柱(Hypersil BPS C18，250 mm×4.6 mm，5 μm)；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；T-214电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)。

葛根、天麻等4味药材均购于湖南省松龄堂中药饮片有限公司，经湖南省中医药研究院中药研究所鉴定室鉴定，均符合《中华人民共和国药典》2010版一部各药材项下相关规定；甲醇(一级色谱纯，Honeywell Burdick & Jackson)；水为重蒸馏水；葛根素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110752-201313)；其他试剂均为分析纯。

2 方法及结果

2.1 浸膏得率的测定

按处方比例称取葛根、天麻等4味药材共45 g，按表1方法分别操作，滤过，合并滤液，减压浓缩至一定体积。精密量取浓缩液适量，置已干燥至恒重的蒸发皿中蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称重，计算浸膏得率[2]。

2.2 葛根素的含量测定

2.2.1 色谱条件 填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为甲醇-水(25∶75)；进样量为10 μL；流速为1 mL·min-1；检测波长为250 nm。理论板数按葛根素峰计算应不低于4000[3-4]。

2.2.2 对照品溶液的配制 取葛根素对照品适量，精密称定，加30%乙醇制成浓度为 80 μg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取2.1项下的浓缩液适量，蒸干，精密加入30%乙醇50 mL，称定重量。加热回流30 min，放冷，再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.2.4 阴性样品溶液 按处方比例称取除葛根以外的其余各3味药材适量，加一定量水煎煮一定时间，滤过，合并滤液，减压浓缩至一定体积，按2.2.3项下方法制备阴性样品溶液。

2.2.5 测定法 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按照2.2.1项下色谱条件测定，结果阴性样品无干扰。见图1。

注：A.葛根素对照品；B.晕瘫通脑片样品；C.阴性样品。图1 晕瘫通脑片提取液HPLC图

2.2.6 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液2.5、5、10、15、20 μL，按2.2.1项下色谱条件测定，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，得回归方程：Y=3 203 659.413 1X-4 189.725 6(r=0.999 9)，线性范围为0.16～1.28 μg。

2.2.7 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，按2.2.1项下色谱条件重复进样6次，结果葛根素峰面积的RSD为0.41%，表明仪器精密度良好。

2.3 单因素试验考察

以葛根素提取量为评价指标，按以下各项方法提取得浓缩液，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定。

2.3.1 提取时间 固定加水量为8倍，提取1次，结果提取时间分别为1、1.5、2、2.5、3 h时，葛根素提取量分别为98.68、136.56、158.24、155.71、154.68 mg，表明在1～2 h内随提取时间的增加，葛根素的提取量增加，说明葛根素需要一定时间才能提取完全；2 h后随提取时间的增加，葛根素含量开始减少，可能是葛根素的化学不稳定性所致。

2.3.2 加水量 固定提取1次，提取时间为2 h，结果加水量分别为6、7、8、9、10倍时，葛根素提取量分别为118.62、135.61、158.94、160.10、159.89 mg。表明当加水量为6～8倍时，葛根素含量不断增加，之后增加加水量葛根素含量增加不明显。

2.3.3 浸泡时间 固定加水量为8倍，提取1次，提取时间为2 h，结果浸泡时间分别为30、60、90、120 min时，葛根素提取量分别为126.83、157.89、158.95、158.99 mg。表明浸泡30～60 min时，葛根素提取量不断增加；浸泡90～120 min，葛根素提取量增加不明显。

2.3.4 提取次数 固定加水量为8倍，提取时间2 h，结果提取数为1、2、3次时，葛根素提取量分别为157.94、228.56、242.66 mg，说明提取2次已基本提取完全。

2.4 Box-Behnken效应面法优选

2.4.1 设计方案与试验结果 由于提取次数为非连续变量，回归处理较困难，故采用软件Design-Expert 8.0.5中的Box-Behnken试验设计原理[5-6]，结合单因素考察试验结果，固定提取次数为2次，选取提取时间、加水量和浸泡时间3个因素为考察因素，分别以X1、X2、X3表示，每个自变量的低、中、高水平分别以-1、0、1进行编码，以葛根素提取量和干膏率的总评“归一值”(overall desirability，OD)为评价指标，根据Hassan法对各个指标进行均一化处理[7]。计算公式为di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)，式中Yi为实测值，Ymin和Ymax是指每一指标在不同次试验中测得的最小值和最大值，OD=(d1×d2…×dk)1/k，k为指标数。方案及试验结果见表1。

表1 Box-Behnken试验设计结果

2.4.2 模型建立及显著性检验 用ANOVA分析效应面的回归参数，见表2。由表2可知，提取时间一次项、提取时间二次项、加水量一次项、加水量二次项、浸泡时间一次项、浸泡时间二次项均达到极显著水平(P<0.01)。利用Design-Expert 8.0.5软件对表1数据进行多元回归拟合，得到OD值对提取时间(A)、加水量(B)和浸泡时间(C)的二次多项回归模型：OD=0.93+0.27A+0.056B+0.049C-0.033AB-0.024AC-0.006 35BC-0.45A2-0.082B2-0.16C2，相关系数r=0.986 5。整体模型达到极显著水平(P<0.01)，表明该二次方程模型比较显著。该方程对试验拟合较好，可以对不同条件下的OD值进行预测。

表2 回归方程方差分析

2.4.3 提取工艺的响应面分析与优化 采用Design-Expert 8.0.5软件，根据回归方程分析结果作出相应的等高线图和曲面图，见图2～4。图2显示在加水量为8倍的条件下，浸泡时间与提取时间对OD值的影响，OD值随着提取时间和浸泡时间的增加均呈二次关系。当提取时间在120 min左右、浸泡时间在60 min左右时，OD值达到最大值；图3显示在浸泡时间为60 min的条件下，提取时间与加水量对OD值的影响，OD值随着提取时间和加水量的增加均呈二次关系。当提取时间在120 min左右、加水量在8倍左右时，OD值达到最大值；图4显示在提取时间为120 min的条件下，加水量和浸泡时间对OD值的影响，OD值随着加水量和浸泡时间的增加均呈二次关系，当浸泡时间在60 min左右、加水量在8倍左右时，OD值达到最大值。

2.4.4 晕瘫通脑片水提工艺参数 结合二次回归模型及响应面法的数学分析结果，确定晕瘫通脑片的最佳水提工艺参数：提取时间为128.4 min，加水量为8.6倍，浸泡时间为63.8 min，在此条件下理论OD值为0.975 7。

图2 提取时间和浸泡时间对OD值影响的等高线和响应面图(左等高线，右响应面)

图3 提取时间和加水量对OD值影响的等高线和响应面图(左等高线，右响应面)

图4 加水量和浸泡时间对OD值影响的等高线和响应面图(左等高线，右响应面)

2.5 验证试验

取处方量药材，平行3份，按确定的最佳水提工艺进行提取，并进行浸膏得率和葛根素提取量的测定，结果见表3。测定的OD值与理论OD值相近，RSD为0.37%，表明该水提工艺稳定可行，且重现良好。

表3 验证试验结果

3 讨论

3.1 试验考察指标的选择

葛根素是从葛根中提取得到的一种异黄酮类化合物，能扩张脑血管，有效改善微循环，清除自由基，具有轻度降压作用[8]。亦有研究表明，葛根素具有保护和改善高血压、冠心病等患者的脑血管张力及弹性等方面的作用，具体表现为局部微血管血流及运动的幅度有增加趋势[9]，故可将葛根素作为本复方的指标参数之一。

3.2 优选工艺方法的选择

Box-Behnken设计是一种可以评价指标和因素间的非线性关系的试验设计方法，与中心复合设计相比，其可不必连续进行多次试验，且在因素数相同的情况下，试验组合数少，因而更经济[10]。本文采用3因素5水平的Box-Behnken试验设计表安排晕瘫通脑片提取工艺试验，以葛根素提取量和干膏率的总评“归一值”为评价指标，用效应面法进行最佳提取工艺条件的筛选，优选出的最佳提取工艺：提取时间为128.4 min，加水量为8.6倍，浸泡时间为63.8 min。经验证试验表明，所建立的模型具有很好的预测性，所选的工艺条件稳定且重现性良好。

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Optimization of Extraction Technology of Yuntan Tongnao Tablets by Box-Behnken Design-response Surface Methodology

LI Yuehui，WANG Yin，YUAN Qingzhao，ZHANG Shuihan*

(HunanTCMAcademy，Changsha，Hunan410006，China)

Objective：To optimize extraction process of Yuntan Tongnao tablets by Box-Behnken design-response surface methodology.Methods：On the basis of single factor tests，Box-Behnken experimental design was employed to investigate effects of the extraction time，water amount and the soaking time on puerarin and yield of the extract.Results：The optimized processing parameters were as follows：soaking time 63.8 minutes，8.6 times volume of water，extract time 128.4minutes，twice extraction.Conclusion：The optimized extraction process is proved to be stable，simple，good predictability by Box-Behnken design-response surface methodology and overall desirability，it provides a basis for technology research of Yuntan Tongnao tablets.

Yuntan Tongnao slices；Box-Behnken design-response surface methodology；overall desirability；puerarin；yield of extract

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.017

2015-01-04)

湖南省中医药科研计划项目(2010053)

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张水寒，研究员，研究方向：中药制剂；Tel：(0731)88881651，E-mail：zhangshuihan0220@126.com