ZHENG Fang, LI Ping, MENG Fan-zheng, ZHAO Jin-sheng.



针刺对大鼠腹部术后胃肠组织中NOS表达的影响

郑方1,李平2,孟凡征3,赵金生3

(1.西安市按摩医院,陕西 710015;2.天津市第三中心医院,天津 300170;3.天津市南开医院,天津 300100)

目的 观察针刺对不全性肠梗阻大鼠术后胃肠组织中一氧化氮合酶(NOS)表达的影响,探讨针刺治疗促进胃肠运动功能紊乱恢复的机制。方法 将40只SD大鼠随机分为治疗1组、治疗2组、模型1组、模型2组和空白组,每组8只。治疗组和模型组均采用丝线单纯结扎法造成不完全性肠梗阻模型。治疗组造模后采用针刺足三里和阳陵泉治疗,其中治疗1组和治疗2组分别治疗1、2 d后解剖及取材。模型1组和模型2组分别于造模1、2 d后解剖及取材。对大鼠肠组织进行形态学观察,并比较各组肠梗阻上段肠管平均周径和胃肠组织标本中NOS含量变化。结果 模型组大鼠造模后回盲部肠管周径与空白组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。模型2组回盲部肠管周径与模型1组比较,差异具有统计学意义(＜0.05)。治疗组治疗后回盲部肠管周径与模型组和治疗2组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。治疗2组回盲部肠管周径与空白组比较,差异无统计学意义(＞0.05)。模型组肠NOS含量与空白组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。治疗1组治疗后肠NOS含量与模型组和治疗2组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。各组肠NOS含量比较,差异均无统计学意义 (＞0.05)。结论 针刺可以通过调节肠组织中NOS含量变化的途径,促进不全性肠梗阻术后大鼠胃肠运动功能的恢复。

针刺疗法;肠梗阻,不完全性;一氧化氮合酶;大鼠

胃肠功能紊乱是一组以消化道症状为主的临床综合征,其主要临床表现有腹痛、腹胀、食欲不振、恶心、呕吐、反酸、嗳气、便秘等[1]。它是胃肠、胆道系统和妇产科疾病开放腹腔术后最常见的并发症之一[2]。临床研究发现,针刺治疗可以缩短患者的肠蠕动恢复时间、首次排气时间和首次排便时间[3]。

一氧化氮(nitric oxide, NO)是近年来研究的新热点,它以左旋精氨酸为底物由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)催化生成,与胃肠道生理病理有着密切的关系。本研究旨在观察大鼠胃和肠组织中NOS含量的变化,来反映针刺是如何通过NO机制促进术后胃肠运动功能的恢复,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

40只清洁级SD大鼠,雌雄各半,体重(250±20) g,由天津市南开医院实验动物中心提供,合格证号[SCXK-(军)2009-003]。采用查随机数字表法将大鼠随机分为治疗1组、治疗2组、模型1组、模型2组和模型组,每组8只。5组大鼠性别、体重分别采用卡方检验和单因素方差分析,基线均衡(＞0.05),具有可比性。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂

10%水合氯醛(武汉吉和昌化工科技有限公司提供),大鼠一氧化氮合成酶 ELISA 试剂盒(E02N0092,上海蓝基生物科技有限公司提供),考马斯亮蓝 G250 蛋白快速染色液(南京建成生物工程研究所提供,生产批号20140214)。

1.2.2 主要仪器

电子秤(Libro);酶标仪(KHB-ST -360);孵育箱(上海医疗器械七厂);洗板机(Ray to RT3000);匀浆机(天津奥佳科技公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备

采用丝线单纯结扎法[4]制备不全性肠梗阻大鼠模型。术前禁食12 h,自由饮水,10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,取仰卧位将其固定于大鼠手术板上,局部消毒备皮后,于大鼠腹白线左侧1 cm处作一长度约2 cm的皮肤切口,逐层分离打开腹腔,用无损伤组织镊轻轻将回盲部提出放于无菌纱布上,用带7号丝线的圆针避开血管穿透肠系膜,在距回盲部3～5 cm处,将回肠肠管和与之并排放置的中心静脉导管一并结扎,然后轻轻将中心静脉导管抽出,肠管还纳回腹腔原位,用连续缝合法缝合腹膜及肌层,再用间断缝合法缝合大鼠皮肤,逐层消毒关闭腹腔。清理伤口后放入笼中。

1.3.2 治疗方法

穴位参照李平教授“通腹降气”针方[3],取大鼠足三里和阳陵泉穴,定位参照《实验针灸学》[5]。造模结束后大鼠清醒即开始针刺治疗。两人配合操作,一人用手抓取活体大鼠以固定,另一人做每秒5次的快频率提插手法操作,持续时间为1 min,每日治疗2次。治疗1组和治疗2组分别治疗1、2 d。

1.3.3 观察指标

治疗结束后麻醉大鼠,开放腹腔,取出距手术梗阻部位以上3～5 cm肠管,将其纵行剖开,平放于滤纸上,取上中下3个位置测量标本肠管周径,并计算出平均周径值,观察大鼠肠管形态学变化;并取胃、肠组织匀浆后上清液,用大鼠NOS试剂盒检测出 OD 值,根据OD值推算出样品的实际浓度,除以样本中蛋白定量的结果,再进一步推算出每克蛋白中含有NOS的比例(pg/g),进行统计学处理分析结果。分别判断NOS对胃和肠运动功能的影响。具体实验流程安排见表1。

表1 实验时间安排表

1.4 统计学方法

所有数据采用 SPSS19.0软件进行统计分析。肠管平均周径和胃肠组织中的NOS含量采用单因素方差分析。各组原始数据属于正态分布,进行两两比较时选用检验。以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 实验结果

空白组因互相撕咬死亡1只,共纳入7只;治疗1组因麻醉药过量死亡1只,共纳入7只。

2.1 治疗组和模型组肠管形态学比较

造模后大鼠腹腔内渗液增加,肠管内积气积液,肠管壁充血水肿,黏膜表面出现散在点片状出血及糜烂灶。经过针刺治疗后观察发现,治疗组腹腔内仅有少量渗液,梗阻部位以上肠管轻度肿胀或未见明显肿胀,肠管内少量积气积液,肠黏膜表面偶见散在点片状出血。详见图1。

2.2 各组大鼠回盲部肠管周径比较

由表2可见,模型组大鼠造模后回盲部肠管周径与空白组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05),提示造模成功。模型2组回盲部肠管周径与模型1组比较,差异具有统计学意义(＜0.05)。治疗组治疗后回盲部肠管周径与模型组和治疗2组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。治疗2组回盲部肠管周径与空白组比较,差异无统计学意义(＞0.05)。

表2 各组梗阻部位以上肠管周径比较 (±s,mm)

表2 各组梗阻部位以上肠管周径比较 (±s,mm)

组别n大鼠回盲部肠管周径 空白组76.00±0.93 模型1组89.88±1.461) 模型2组812.00±1.311)2) 治疗1组78.00±0.821)2)3) 治疗2组87.00±0.762)3)4)

注:与空白组比较1)＜0.05;与模型1组比较2)＜0.05;与模型2组比较3)＜0.05;与治疗1组比较4)＜0.05

A 模型1组 B 治疗1组

C 模型2组 D 治疗2组

图1 各组形态学示意图

2.3 各组大鼠胃、肠NOS含量比较

由表3可见,模型组肠NOS含量与空白组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。治疗1组治疗后肠NOS含量与模型组和治疗2组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。治疗2组治疗后肠NOS含量与模型组比较,差异均无统计学意义(＞0.05)。各组肠NOS含量比较,差异均无统计学意义(＞0.05)。

表3 各组大鼠胃、肠NOS含量比较 (±s,pg/g)

表3 各组大鼠胃、肠NOS含量比较 (±s,pg/g)

组别n肠胃 空白组70.86±0.470.76±0.16 模型1组8 0.50±0.101)2)0.80±0.20 模型2组8 0.45±0.221)2)0.87±0.25 治疗1组71.02±0.480.91±0.29 治疗2组8 0.60±0.252)0.90±0.26

注:与空白组比较1)＜0.05;与治疗1组比较2)＜0.05

3 讨论

胃肠功能紊乱是腹部外科术后最常见的并发症之一,除了胃肠外科手术以外,肝胆手术、妇科手术、心脏手术、脊柱手术以及麻醉都会影响术后胃肠功能的恢复[6-9],术后如何尽早地恢复胃肠自主运动功能是患者康复的关键。大量文献报道了针灸对术后胃肠功能恢复具有双向调整作用,并已经广泛应用于临床胃肠疾病的治疗和术后胃肠功能的恢复方面[10-13]。其可能的作用机制有胃肠电生理、胃肠液分泌、胃肠激素及血流等多个方面[14]。本研究旨在探讨除以上机制外,针刺还可以通过NO途径改善胃肠运动功能及其具体作用机制,为临床针刺治疗腹部术后胃肠功能紊乱提供更有力的支持。

自然界中的NO是一种结构简单的气体分子,其化学性质活泼,在动物体内的是一种神经递质和信使分子,在细胞内产生后直接透过生物膜自由扩散进入周围的靶细胞,执行信号分子的功能。NO作为一种新型的胃肠道内非肾上腺素能非胆碱能抑制性神经(non adrenergical non-cholinergical, NANC)递质,通过3种方式作用于胃肠平滑肌[15-18],①含NOS的NANC能神经释放NO到细胞外液中,NO再作用于平滑肌靶细胞,影响平滑肌细胞的舒张功能;②不含NOS的NANC能神经通过释放VIP和ATP作用于含NOS的NANC能神经元或非神经元细胞(如星状胶质细胞),刺激它们生成并释放NO;③另外VIP和ATP这类递质也可直接作用于平滑肌靶细胞,激活胞浆内NOS生成NO,NO再进一步作用于平滑肌细胞。NO对胃肠功能是一种重要的抑制性递质,当其含量增加时,使胃肠运动功能障碍,肠蠕动减慢,NO的含量与胃肠运动呈负相关,NOS与NO呈负相

关,NOS与胃肠蠕动呈正相关。生物体内的NO是由L-精氨酸在还原型辅酶Ⅱ和氧气存在的条件下,由NOS催化生成L-胍氨酸时释放的[19-21]。由于NO在生物体内半衰期极短(大约几秒钟),很快就被转变为硝酸盐/亚硝酸盐(NO-2/NO-3)的代谢产物,所以临床上不能直接测定NO含量,而是通过测定其相关代谢产物含量间接体现NO含量。本实验选择通过检测胃肠组织中的NOS浓度的变化,间接反映组织中NO的含量,并探讨NOS在术后胃肠功能紊乱过程中的可能作用及其意义。

本实验首先对大鼠治疗前后肠管形态学进行观察,并进一步通过大鼠肠梗阻上段肠管平均周径,以及大鼠胃、肠组织标本中每克蛋白所含有NOS检测值进行统计学分析。造模后大鼠梗阻肠管内积气积液,肠管水肿和胀气显著,肠黏膜表面出现散在点片状出血及糜烂灶。针刺治疗后肠管形态学呈不同程度好转,肠管平均周径减少,并随疗程延长情况进一步改善,治疗2 d后肠管胀气情况接近于术前水平。肠组织标本中模型组与空白组比较,NOS降低且具有统计学意义,造模成功后NOS降低,NO生成增加,对平滑肌的舒张作用增强,肠蠕动减慢。模型1组与模型2组比较,NOS增加但无统计学意义(＞0.05),肠蠕动不会随着病程的延长而进一步减缓。

肠组织标本中,治疗1组NOS含量较模型1组显著增加(＜0.05),治疗2组NOS含量较模型2组增加 (＞0.05),治疗1组NOS含量增加较治疗2组更显著(＜0.05),提示针刺治疗可以促进肠蠕动恢复,治疗1 d的效果优于治疗2 d。各组间胃组织标本中NOS比较,差异均无统计学意义(＞0.05),但造模后NOS整体呈增加趋势,胃运动功能可能反射性增强,治疗1组和治疗2组胃NOS含量基本一致(＞0.05),提示针刺治疗对胃组织标本的NOS含量的变化无影响,针刺不能通过刺激NO含量变化的途径促进术后胃蠕动的恢复。

综上所述,针刺可以促进不全性肠梗阻大鼠术后胃肠运动功能的恢复,促进肠管积气积液的排出,使大鼠肠管胀气情况得到改善,使并发症发生的风险降低。针刺从多途径、多靶点调节胃肠运动功能,这种通肠组织中NOS含量的变化,继而影响NO的途径来调节肠管平滑肌的收缩和舒张是其调节方式之一。而针刺不能通过NO途径来影响胃的运动功能。采用针刺治疗腹部术后胃肠运动功能紊乱临床疗效确切,本研究从实验角度显示其有效性和科学性,值得临床进一步推广及应用。

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Effect of Acupuncture on the Expression of NOS in Gastrointestinal Tissues after Abdominal Operation in Rats

1,2,-3,-3.

1.,710015,; 2.,300170,; 3.,300170,

Objective To observe the effect of acupuncture on the expression of nitricoxide synthase (NOS) in gastrointestinal tissues after operation for incomplete intestinal obstruction in rats, and to explore the mechanism of acupuncture in promoting the recovery of gastrointestinal motility. Methods Forty Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into treatment group 1, treatment group 2, model group 1, model group 2, and a normal control group, 8 rats in each group. The incomplete intestinal obstruction models were developed by using single ligation method in treatment groups and model groups. Afterwards, the treatment groups were intervened by acupuncture at Zusanli (ST 36) and Yanglingquan (GB 34), and rats in treatment group 1 and 2 were respectively dissected after 1-day and 2-day treatment. The rats in model group 1 and 2 were respectively dissected 1 d and 2 d after modeling. The morphological observation was performed on rat’s intestinal tissues, and the average diameter of the upper part of the obstructed intestine and the expression of NOS in gastrointestinal tissues were compared. Results The average ileocecal diameter after modeling was significantly different from that in the normal control group (＜0.05). There was a significant difference in comparing the ileocecal diameter between model group 1 and 2 (＜0.05). The ileocecal diameter in treatment group 1 was significantly different from that in treatment group 2 and model groups (P＜0.05). The ileocecal diameter in treatment group 2 was insignificantly different from that in the normal control group (＞0.05). The NOS content in model groups was significantly different from that in the normal group (＜0.05). The NOS content in treatment group 1 was markedly different from that in model groups and treatment group 2 (＜0.05) after intervention. There were no significant inter-group differences in comparing NOS content (＞0.05). Conclusions Acupuncture can promote the recovery of gastrointestinal motility by regulating intestinal NOS content in rats after operation for incomplete intestinal obstruction.

Acupuncture therapy; Intestinal obstruction, Incomplete; NOS; Rats

郑方(1982 - ),女,主治医师

R2-03

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.09.0888

2015-03-14

A