周建红等

摘要：按照中华人民共和国农业行业标准（NY/T 772-2004）设计合成了针对H5的引物，建立了一种对禽流感（AIV）一步法RT-PCR的快速诊断方法。结果表明，该方法具有高效，快速，特异性强，敏感性高等特点，可基本满足当前的检测需要。

关键词：禽流感；RT-PCR；检测

中图分类号：S858.3 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2015）07-0011-02

禽流感是由A 型流感病毒（AIV）引起的一种禽类的疾病综合征。因其传播快、危害大，被世界动物卫生组织（OIE）列为A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病[1]。该病对养殖业生产危害性极大，是世界各国防疫的重点对象。控制禽流感关键在于早发现、早隔离、早预防。因而快速、敏感、特异的诊断方法受到人们的关注。目前对AIV进行快速检测的方法有IFA、ELISA、RT-PCR、Real-time RT-PCR、NASBA和Microarray等。随着PCR技术的不断完善和发展，该技术已逐渐应用于各类疫病的诊断。对于禽流感检测，它可通过基因序列和结构分析，从分子和基因水平直接对临床病料或鸡胚培养物进行禽流感病毒（AIV）型、亚型及不同毒力株的检测[2]。本文就RT-PCR技术检测H5亚型禽流感病毒的试验报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）禽流感病毒阳性对照（已灭活）。

（2）主要试剂：RNA提取试剂盒为美国OMEGA公司产品。RT-PCR试剂盒为宝生物工程大连有限公司产品。低分子量蛋白质Marker、琼脂糖为OXOID产品。

（3）引物：根据中华人民共和国农业行业标准（NY/T 772-2004）合成了1对引物，上游引物（P1）：5′-ACACATGCYCARGACATACT-3′；下游引物（P2）：5′-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT-3′；引物之间跨度为545 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 病毒总RNA的提取

采集的口腔、泄殖腔棉拭子分离后收集上清，RNA 病毒的抽提按试剂盒说明书进行。

1.3 RT-PCR反应

RT-PCR采用一步法，参照TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）（TaKaRa）操作说明，利用上述引物P1、P2分别对提取的RNA进行RT-PCR 扩增。RT-PCR 反应体系如下：10×One step RNA PCR Buffer（TaKaRa）5 μL，dNTP（10 mmol/L）5 μL，MgCl2（25 mmol/L）10 μL，RNase Inhibitor （40 U/μL）1 μL，AMV RTase XL（5 U/μL） 1 μL，AMV-Optimized Taq（5 U/μL）1 μL，上下游引物（20 μmol/L）各1 μL，RNA 模板3 μL，补充ddH2O至50 μL。反应程序：50 ℃反转录30 min；94 ℃预变性2 min；94 ℃变性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。

1.4 特异性试验

取CSFV、PRRSV、NDV按照OMEGA说明书提取总RNA，按照1.3进行RT-PCR。

1.5 RT-PCR产物电泳检测

RT-PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，当溴酚蓝电泳至适当位置，在长波紫外灯下/凝胶成像系统观察或拍照。

2 结果与分析

2.1 禽流感RT-PCR扩增结果

提取总RNA，RT-PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，阳性对照获得大小为545 bp 左右的片段，与设计长度一致（图1）。

2.2 特异性试验结果

特异性试验结果表明，仅禽流感阳性株在545 bp处出现了一条带，而CSFV、PRRSV、NDV均为阴性。

2.3 临床样品的检测结果

从某鸡场采集40份样品进行RT-PCR检测，未见有阳性。

3 小结与讨论

H5亚型禽流感由于在家禽中流行较为广泛、危害大，特别是高致病性禽流感可引起鸡群100%死亡，给养殖业造成了巨大损失。

为进一步减少损失，及时对禽流感的发生做出早期诊断，并进行预警预报，我们按照中华人民共和国农业行业标准（NY/T 772-2004）设计合成了针对H5的引物，建立了一种对AIV一步法RT-PCR的快速诊断方法，该方法具有高效，快速，特异性强，敏感性高等特点，可基本满足当前的检测需要，为禽流感的预防和确诊提供了保障。

参考文献：

[1] 卡尔尼克B W.禽病学[M].第九版.北京农业大学出版社.199l.

[2] 彭晓玲，兰 玲，马亚珍，等. 高致病性禽流感RT-PCR快速诊断方法的建立[J].动物医学进展，2009，30（1）： 40-42.