吴华俊+罗淋淋+林同

摘要：化学杀虫剂滥用导致昆虫抗药性问题日渐突出，研究昆虫抗药性是为了更有效地防治害虫。基因芯片为害虫抗药性研究提供了理想的平台。综述了基因芯片技术在昆虫抗药性研究中的应用进展，重点总结了细胞色素P450氧化酶、酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶等解毒酶基因和乙酰胆碱酯酶等靶标酶基因的表达情况，为在分子水平上研究昆虫抗药性提供了依据，为从基因组学水平深入、全面开展昆虫与农药的互作研究奠定了基础。

关键词：基因芯片；昆虫抗药性；解毒酶基因；靶标基因

中图分类号：S481+.4；S433；Q811.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）14-3335-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.14.002

Application of Microarray Technology on Insect Resistance Research

WU Hua-Jun，LUO Lin-Lin，LIN Tong

（College of Forestry， South China Agricultural University， Guangzhou 510642，China）

Abstract： Abuse of chemical pesticides leads to the problem of insect resistance， which has become increasingly prominent. The objective of study on insect resistance is to control insect pests more effectively. The progress of application of microarray technology on insect resistance research， especially the expression of the genes encoding cytochrome P450 monoxygneases， estaesres， glutathione-S-transferases and acetylcholinestcrase were reviewed in this paper to provide the references for study on insect resistance at the molecular level and lay the foundation for comprehensive interaction research between insects and pesticides from the genomics level in-depth.

Key words： microarray； insect resistance； detoxifying enzyme gene； targe site gene

化学杀虫剂在人类近几十年的农业生产中扮演着重要角色，特别是在虫害综合治理方面起到了重要作用。但杀虫剂的大量持续性使用导致了昆虫抗药性的发生和发展，世界卫生组织（WHO）对昆虫抗药性的定义为：“形成具有耐受杀死正常种群大部分个体的药量的能力。”昆虫已对有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类等杀虫剂均产生了抗药性[1]。据报道，截至2007年至少有543种昆虫对杀虫剂产生了抗药性[2]。昆虫日益增强的抗药性造成了农作物的大量减产和害虫的再猖狂，农药的不合理使用甚至加剧了人类各种疾病的蔓延和环境污染，造成经济社会的重大损失。研究昆虫产生抗药性的机理对防止和延缓昆虫抗药性至关重要。确定昆虫抗性的产生、发展及抗性水平是提高害虫防治效果的关键。传统的抗药性检测方法由于存在费时、耗力、所需样虫数量大等不足，很难适应抗药性治理的需要[3]。近年来，基因芯片的出现和应用为害虫抗药性研究提供了理想的研究平台。

基因芯片技术是 20世纪 90年代发展起来的分子生物学技术，是各学科交叉综合发展的产物。1995年第一块基因微矩阵芯片在斯坦福大学诞生，并首先被应用于人类基因组的研究[4]。1996年世界上第一块商业化的基因芯片研制成功[5]。中国基因芯片产业从20世纪末起步，并已涉及到多个应用领域，主要产品包括基因表达谱芯片、有害生物监测芯片、转基因农产品检测芯片和人类病毒基因检测芯片[6]。同时，基因芯片在测量基因组大量基因表达水平上有着优异的表现，已经在许多不同的生物体上得到运用，包括酵母、线虫、人类、白鼠、果蝇和植物上[7-12]。基因芯片相比于传统的研究方法更快捷、高效地对昆虫抗药性的产生、发展机制做出检测，有助于人们从分子水平上去研究昆虫抗药性。

本文综合了国内外用基因芯片平台研究害虫抗药性的研究成果，综述了由基因芯片检测到的抗药性基因的表达变化情况和与此相关的昆虫抗药性产生及发展的分子机制，为在分子水平上研究昆虫抗药性提供依据，为从基因组学水平深入、全面开展昆虫与农药的互作研究奠定基础。

1 基因芯片概述

1.1 原理及特点

基因芯片原理是把核酸片段作为识别分子，按预先设置的排列固定于载体的表面形成微点阵，利用反向固相杂交技术，将标记的样品分子与微点阵上的核酸探针杂交，以实现多达数万个分子之间的杂交反应，并利用特定的检测系统来高通量、大规模地分析检测样品中特定基因分子的存在或者多个基因的表达状况[13]。基因芯片最显著的特点是高通量、高度并行性、高灵敏度[14]。

1.2 制作方法

用于构建基因芯片有多种方法，一类是点样法，即直接将大量合成好的探针通过机器人有序地点印在芯片表面。用这种方法，cDNA微阵列能在基板上点上万个克隆。另一类是在固相支持物表面进行的原位合成。原位合成又包括分子印章合成、压电打印和光引导等3种途径[15]。分子印章合成法是根据需要设计出一组图形不同的微阵列印章，然后把不同碱基的核苷酸涂在不同的印章表面，依次压印在基板表面；压电打印法通过压电晶体或其他方式从微小的喷嘴内把生物样品喷射到载体上，类似于喷墨打印技术；光引导即将光刻技术与DNA化学合成技术相结合，以化学合成的方法使DNA片段固定于芯片载体表面，一般用于寡核苷酸芯片的制作[16]。endprint

1.3 分类

按照所用载体材料不同分类，可分为硝酸纤维素膜芯片、尼龙薄膜芯片等有机合成物片基型芯片；玻璃芯片、陶瓷芯片等无机片基型芯片[17]。据载体上所储存的生物信息的类型分类可分为寡核苷酸芯片、cDNA芯片。寡核苷酸芯片是指把已合成好的一系列寡核苷酸固定在介质上，制成高密度的寡核苷酸阵列，并与荧光标记的靶基因杂交进行检测。寡核苷酸芯片主要用于测序、点突变、表达谱分析等[18]。cDNA芯片是指用点样法制备的较低密度的尼龙膜或玻璃芯片，固定在芯片的探针是cDNA片段，把未知序列的cDNA片段用荧光标记后与靶基因杂交，通过点和耦合器件与激光共聚焦荧光扫描仪对信号强度进行检测[19]。根据基因芯片的功能分为基因表达谱芯片、测序芯片、克隆选择和文库筛选芯片、物种鉴定和基因组分型芯片、多态性分析芯片、突变检测芯片等。其中，基因表达谱分析是基因芯片技术应用最为广泛的，它使得人们能够更清晰地认识生命世界。表达谱芯片可将克隆到的大量基因特异的探针或其cDNA片段固定在一块DNA芯片上，对来源于不同个体或者同一个体的不同基因发生的变化进行检测[20]。目前的昆虫芯片主要是表达谱芯片，用于研究昆虫在发育过程中或在某一因素影响下昆虫基因表达谱的变化，例如在低温刺激、高温刺激、蛋白酶抑制剂、核型多角体病毒、农药胁迫下的基因表达谱等。

2 基因芯片检测到的解毒酶基因

解毒酶的活性显著增高是昆虫抗药性的重要机制之一，意味着对杀虫剂的解毒能力增强，加速代谢进入昆虫体内的杀虫剂，使其变为无毒或低毒物质，从而使杀虫剂不能达到作用部位，由此产生对杀虫剂的抗性，即代谢抗性[21]。代谢抗性作用的发挥依赖于细胞色素P450氧化酶（Cytochrome P450 monoxygneases，P450s）、非专一性酯酶（Estaesres，ESTs）、谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione-S-transferases，GSTs）三大解毒酶家族[22]。昆虫代谢抗性涉及氧化还原作用、水解作用、基团转移作用及轭合作用，通过上述生化过程把农药转变为易溶于水的极性分子，从而排出体外，达到抗药性效果[23]。表达谱基因芯片检测到的解毒酶基因表达情况见表1。

2.1 细胞色素P450氧化酶（P450）

P450是昆虫体内主要解毒酶系，是昆虫对DDT和拟除虫菊酯类等杀虫剂产生抗性的主要原因之一，并与昆虫交互抗性的产生密切相关，P450酶系的解毒代谢能力增强是因为抗性昆虫体内P450基因过表达。昆虫P450基因是由Ray首次发现的[24]，目前从已知的235个P450亚家族中已经克隆出1 000多个P450基因[25]。与抗性相关的P450基因主要有6个：CYP6A1、CYP6A2、CYP6A8、CYP6A9、CYP6B2和CYP6D1等[26]。

Daborn等[27]利用基因芯片技术和逆转录PCR技术对模式昆虫果蝇（Drosophila melanogaster）DDT抗性品系进行研究，在其P450基因组中发现只有CYP6G1转录水平很高，其mRNA的转录水平是敏感品系的10～100倍。通过基因芯片对果蝇的全基因表达谱的进行分析，发现CYP6G1基因发生了过表达，并发现了存在与对DTT产生抗性有关的等位基因，这等位基因是以嵌入CYP6G1基因的5′端进行表达的[28]。Goff等[29]通过聚合酶链式反应（PCR）扩增果蝇的132个基因，并将其制成基因芯片。这些基因中含有果蝇细胞色素P450家族多个基因，发现果蝇的一个野生抗性品系CYP6家族的基因发生了上调表达，并发现CYP6A8基因的上调表达与果蝇对烟碱类杀虫剂吡虫啉的抗性相关，但并不会导致抗性果蝇对马拉硫磷产生交互抗性；而果蝇对多种杀虫剂的交互抗性则被认为是与CYP6G1基因相关。

Shen等[30]通过PCR扩增和克隆的方式得到了淡色库蚊（Culex pipiens pallens）810个cDNA基因，其中24个CYP4基因被点样在尼龙薄膜制成微阵列cDNA芯片。这24个克隆基因发生了表达改变，通过查找GenBank发现这些克隆基因属于P450基因。在淡色库蚊抗溴氰菊酯品系及敏感品系中有CYP4H21、CYP4H22v1、CYP4H23v2、CYP4J4v2、CYP

4J6v1和CYP4J6v2等6个基因表达水平发生显著差异，且均在抗性品系中过表达，与敏感品系相比高达3.1～97.0倍。说明CYP4基因与淡色库蚊抗药性的产生有关。丁矛[31]利用中华蜜蜂（Apis cerana）、德国小蠊（Blattella germanica）等6种重要昆虫的41个昆虫抗药性相关基因，构建成含2 808个靶标点的昆虫抗药性相关基因芯片，并利用该芯片对淡色库蚊的抗性相关基因的差异表达进行研究，发现有6个细胞色素P450基因表达上调，其中3个属于CYP4家族，2个属于CYP6家族。

赵岩等[32]根据NCBI数据库公布的德国小蠊所有已知序列信息，设计合成寡核苷酸（Oligo）探针，去除冗余序列后共85条，点制在氨基基片上，制成德国小蠊基因芯片。利用该芯片对抗性品系与敏感品系德国小蠊进行表达谱检测，筛选与抗性相关的差异表达基因，并用实时荧光定量PCR进行验证。一共筛选出差异表达基因5个，其中有一个属于P450基因表达上调，并认为上调基因CYP6K1可能与抗性密切相关。Christian等[33]制作了冈比亚按蚊毒理芯片，发现CYP6P3、CYP6M3基因在雌雄中都出现了上调表达，但上调表达幅度都是雄虫高于雌虫。其余的P450基因例如CYP6P9、CYP6M2、CYP6R1、CYP12f2、CYP6AG1、CYP9J5、CYP9M1、CYP6Z1、CYP6AG2、CYP6M1、CYP9J等与敏感品系相比都出现不同程度的上调表达。Wang等[34]利用全基因组核苷酸序列基因芯片研究辛硫磷处理后的家蚕幼虫，24 h后，检测其基因表达情况。结果显示，6 177个基因在家蚕幼虫中表达，其中68个基因上调表达，且与对照组表达差异最大可达26倍；179个基因下调表达且最大可达29倍。对此的分析结果表明它们的功能可以分为10类：上调表达基因主要涉及脂肪代谢、糖代谢、蛋白水解等过程；下调表达基因主要涉及细胞分裂、转录调节、细胞内信号放大等过程。endprint

2.2 非专一性酯酶（EST）基因

EST是代谢多种杀虫剂特别是含有酯键的有机磷类和氨基甲酸酯类杀虫剂的一类酶，可分为3类：羧酸酯酶（Carboxylesterases，COEs）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）和酰胺酯酶（Amidasc）。EST相关抗性的分子机制主要有基因扩增、结构基因突变和转录水平的调节等[35]。

Vontas等[36]把冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）的基因制成基因芯片用于检测杀虫剂抗性品系和敏感品系按蚊的基因表达区别。7 000个基因中有36%的基因在拟除虫菊酯抗性品系中和敏感品系中表达不一致，通过实时荧光定量PCR测定发现抗性品系的基因出现了上调表达。为了进一步明确哪些基因上调表达，Vontas等[36]把其中的231个基因制成了毒理基因芯片，发现这是由于解毒酶代谢产生的抗性。其中，羧酸酯酶基因COEJHE2产生了上调表达，比敏感品系高3.11倍表达。这证明了COE对昆虫抗药性的产生有着重要联系，这与COE在其他昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性中起作用的报道是相符的[37，38]。

2.3 谷胱甘肽-S-转移酶（GST）

GST可以代谢拟除虫菊酯类杀虫剂并与拟除虫菊酯类杀虫剂分子结合而起到保护作用，可以诱导脂类过氧化物，避免昆虫组织受氧化损伤[38]。

David等[39]分别用拟除虫菊酯和DDT处理冈比亚按蚊，并制备230个基因探针制成微阵列毒理芯片进行抗药性研究。其中包括有35个GST基因和103个P450基因及其他各类基因。利用PCR进行检测分析，发现在拟除虫菊酯抗性品系中，GST和P450基因都发生了上调表达，但GSTE2基因表达上调幅度最大，与敏感品系相比相差2.36倍。在DDT抗性品系中，14个基因与敏感品系相比发生了超过1.5倍的过表达，其中GSTE2以3.88倍的过表达量仍高于其他基因。在两种杀虫剂抗性品系中P450基因上调表达的数量分别为1个和7个，且上调表达量与敏感品系相比均高出1.5倍，但都低于GSTE2基因的上调表达量。说明GSTE2是昆虫产生抗性的一个重要基因。Vontas等[36]制作的冈比亚按蚊毒理芯片也发现了GSTS1-1、GSTS1-2、GSTMIC2等3个基因发生了表达上调，与敏感品系相比基因上调表达幅度在1.68～3.68倍。Christian等[33]制作了含有254个cDNA探针的冈比亚按蚊毒理芯片，用于检测3龄的冈比亚按蚊雌雄虫在用拟除虫菊酯类杀虫剂处理后产生的变化。结果发现九成以上的基因都出现了上调表达，其中GSTS112、GSTMS3、GSTD2基因只在雄性冈比亚按蚊中出现了上调表达。与敏感品系相比，GSTS1-1基因上调表达幅度最大达2.5倍，上调表达幅度最小为GSTD2基因，为1.6倍。

3 基因芯片检测到的杀虫剂靶标基因

昆虫在杀虫剂的长期选择下，其杀虫剂作用的靶标部位的敏感性也可能降低，从而形成靶标抗性。昆虫农药靶标抗性主要涉及乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinestcrase，AChE）、神经轴突钠离子通道（Insensitive sodium channel，SC）和γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）受体氯离子通道三大作用靶标。靶标抗性容易引起作用于该靶标的一类杀虫剂产生交互抗性，家蝇已被证实对目前使用的多种杀虫剂产生抗性[40]。

昆虫乙酰胆碱酯酶由Ace基因编码，是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。Ace基因发生突变会引起AChE对这些杀虫剂的敏感性降低，使昆虫产生抗性[41]。对有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂不敏感的昆虫，其抗性的产生既可能是由于虫体内AChE酶量过高所致，也可能是由于AChE的结构发生了改变[42]。Chung等[43]在GenBank中找到烟粉虱（Bemisia tabaci）的12条引物用于PCR扩增，所得的PCR产物制作成寡核苷酸芯片用于检测烟粉虱相关靶标基因在拟除虫菊酯类杀虫剂和有机磷类杀虫剂作用下产生的变化。发现烟粉虱Ace-F329基因和烟粉虱电压门控钠离子通道基因中的vgsc-M918、vgscI925和vgsc-T929基因发生了突变（表2），证明Ace-F392W与烟粉虱对机磷类杀虫剂抗性产生相关，这点与Alon等[44]研究烟粉虱靶标抗药性时得出的结论是一致的；vgscI925和vgsc-T929基因的突变与烟粉虱对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性高度相关，vgsc-M918基因突变也与烟粉虱对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性产生相关。

在昆虫毒理学中，GABA受体在昆虫的GABA 传递系统中起重要作用。GABA受体被破坏或被取代都会导致昆虫的神经冲动传导受阻[45]。GABA受体是阿维菌素、环戊二烯类、二环苯钾酸酯类和二环磷脂类杀虫剂的作用靶标[21]。一般认为，GABA受体氯离子通道相关的抗性主要是由基因突变所致。丁矛[31]构建了由中华蜜蜂、德国小蠊等6种重要昆虫的41个昆虫抗药性相关基因，共2 808个靶标点构成的基因芯片，发现淡色库蚊的一个抗性品系GABA基因表达水平上调（表2）。

4 基因芯片检测到的表皮蛋白基因

杀虫剂要通过昆虫的表皮、呼吸系统或肠腔进入昆虫体内，达到毒杀昆虫的目的。杀虫剂穿透昆虫表皮速率的降低是昆虫产生抗性的有效机制之一[46]。表皮穿透效率的降低会导致杀虫剂在昆虫体内的渗透速度变慢，从而延缓其到达靶标部位的时间。表皮穿透性降低机制在家蝇（Musca domesticaLinnaeus）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）、淡色库蚊（Culex pipiens pallens）等均有发现[47]。

Wei等[48]用杀虫脲处理松墨天牛幼虫4 h后，用寡核苷酸基因芯片检测基因表达情况，发现53条基因上调表达，311条基因下调表达；其中3个表皮蛋白基因（Cpr49Aa、Cpr67B、Cpr11A）表达水平下调。推测此时松墨天牛的表皮蛋白基因的表达受到杀虫脲的抑制，可能尚未参与对杀虫脲的抗性反应。endprint

5 结语及展望

基因芯片是由大量DNA或寡聚核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其通过与样本杂交后经检测，可以大规模地获取样本中DNA或RNA信息，具有微型化、集约化和标准化的优点，可以同时对数以千计、乃至万计的基因进行研究和多基因的检测，彻底改变了传统的分子生物学方法只能对某一个或某几个基因进行研究的局限，被美国权威杂志“SCIENCE”评为1998年度世界十大科技进展之一。

基因芯片用基因表达来解读生物功能，说服力强、包含的信息量相当丰富；系统、全方位地监测基因表达谱是研究复杂的生命过程的最好方法之一。由于基因表达与其功能密切相关，因而通过阐明在一定的生理条件下哪些基因上调表达或下调表达来揭示基因功能或调控通路互作是可能的，故把基因表达数据作为生物系统信息的来源具有重要意义[14]。

随着生产、生活中对各种杀虫剂的大量使用，昆虫抗药性问题日益突出，已成为一个世界性问题。除了个别领域如昆虫环境毒理学属于宏观范围，包括抗性在内的昆虫毒理学几乎全部问题都是生理生化问题，都需要从分子水平上予以解决[49]。近年来，分子生物学和基因工程的研究突飞猛进，促进了杀虫剂分子毒理学的发展，现已从分子、基因水平阐述杀虫剂的作用机理[40]。利用基因芯片等技术，研究人员可同时观察化合物作用后数以千计的基因表达改变，通过对各类基因表达模式与毒性效应相互关系的整合，更有利于在分子水平上对毒性机制的阐明，往往具有更好的敏感性和特异[50]。

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