GC法测定不同产地五味子藤茎中挥发油含量

2015-09-06徐思思徐惠芳

山西中医药大学学报 2015年4期

徐思思，徐惠芳

（武汉市中医医院，湖北武汉430010）

五味子为木兰科五味子属多年生木质藤本，主产于辽宁、黑龙江、吉林等省，俗称“北五味子”。具益气生津、补肾养心、收敛固涩的功效［1］。五味子中主要含有多糖、挥发油和木脂素类成分等［2］。五味子藤茎为其干燥藤茎，人们常把晒干的藤茎代替花椒，习称“山花椒藤”［3］。五味子藤茎晒干后有优良的保健、调味功效［4］。

目前对五味子果实及种子的研究较多［5-6］，而五味子藤茎挥发油方面的研究则相对较少［7-8］。挥发油中主要含大量倍半萜烯成分，其中蒎烯对白色念珠菌有明显的抑菌与杀菌作用，以及抗氧化、抗衰老作用［9］；柠檬烯具有抑菌活性与诱导癌细胞凋亡作用［10］；月桂烯和蒎烯是合成萜类单体香料的重要原料。本研究侧重对不同栽培环境下五味子藤茎中挥发油含量进行研究，为五味子的药食两用提供可靠的科学依据。

1 实验材料

1.1 药材与试剂

五味子藤茎材料主要采集于东北及华北地区野生品，经湖北中医药大学药用植物教研室陈科力教授鉴定为木兰科植物五味子的藤茎。药材经洗净后，自然干燥，粉碎过40目筛，备用。

对照品：α-蒎烯（批号：110897-200502，含量≥99%，中国食品药品检定研究院）、β-蒎烯（批号：YA0402SB13，含量≥99%，上海源叶生物科技有限公司）、月桂烯（批号：YA0402SA13，含量≥85%，上海源叶生物科技有限公司）、柠檬烯（批号：20130116，含量≥98%，上海源叶生物科技有限公司）、正十三烷（批号：CAS＃629-50-5，含量≥99%，上海源叶生物科技有限公司）。正己烷为色谱级，乙醚、氯化钠、无水硫酸钠均为分析级。

1.2 实验仪器

Agilent 6890N气相色谱仪，FID检测器，石英毛细管柱（大连中汇达科学仪器有限公司），Agilent化学工作站，SARTORIUS-CP225D十万分之一天平（德国SARTORIUS公司）。挥发油提取器，万能粉碎机（北京普诺众达科技有限公司），ME104E型电子分析天平（梅特勒-托利多公司），KD-DTC3102型电子分析天平（梅特勒-托利多公司），电子调温电热套（北京科华实验仪器有限公司），微量进样器等。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：HP-5MS石英毛细管柱（30 m×0.32 nm×0.5 μm）；检测器：FID；进样口温度：230 ℃；检测器温度：250℃；程序升温：柱温从50℃开始，以8℃/min升温至 130 ℃；载气：N2；流速：1.0 mL/min；进样方式：分流进样，分流比 10∶1；进样量：1 μL。理论板数按 α-蒎烯计算大于10000。对照品和样品色谱图见图1［11-12］。

2.2 溶液的制备

2.2.1 内标溶液的配制取正十三烷适量，精密称定，置于10 mL量瓶中，用色谱级正己烷稀释至刻度线，摇匀，配成浓度为10.19 mg/mL的内标溶液。

图1 五味子藤茎样品（A）和对照品（B）色谱图

2.2.2 供试品溶液配制精密称取一定粉碎度的五味子藤茎粉末50.00 g，置1000 mL圆底烧瓶中，参照2010版《中国药典》第一部附录XD挥发油测定法。加一定比例的水与碎瓷片数片，振摇，混合后连接挥发油测定器与回流冷凝管。自冷凝管上端加入饱和氯化钠溶液使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶为止。置电子调温电热套上浸泡一定时间，之后缓缓加热至沸，并保持微沸约数小时。提取完毕后，停止加热，放置片刻，开启测定器下端的活塞，将氯化钠溶液缓缓放出，至油层上端到达刻度0线上面5 mm处为止。放置1 h以上，再开启活塞使油层下降至其下端恰与刻度0线平齐。读取挥发油量，收集挥发油于2 mL EP管中，加适量无水硫酸钠脱水，密闭，振摇，至烘箱中45℃静置5 h。加2 mL乙醚于挥发油提取器中，缓缓振摇，使黏附于壁上的挥发油溶于乙醚中，收集乙醚萃取液于2 mL EP管中，加少量无水硫酸钠脱水，常温挥干乙醚。待两管中挥发油变成澄清的淡黄色后，合并。将脱水后的纯净挥发油置于5 mL量瓶中，加入内标溶液0.1 mL，加色谱级正己烷定容至刻度，摇匀，即得，备用［9］。

2.2.3 对照品溶液制备分别取对照品α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和柠檬烯适量，精密称定，置于2 mL容量瓶中，分别加色谱级正己烷稀释至刻度线，摇匀，配成浓度分别为 5.46 mg/mL，6.92 mg/mL，6.45 mg/mL，5.45 mg/mL的对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察分别用相应量程移液枪精密吸取 α-蒎烯对照品母液 0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.30 mL；β-蒎烯对照品母液 0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL；月桂烯对照品母液 0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL；柠檬烯对照品母液 0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL，将上述溶液依次对应分别置于5 mL量瓶中，精密加入内标溶液0.1 mL，再加正己烷（色谱级）稀释至刻度线，摇匀，吸取1 μL进样测定。以各对照品溶液的质量浓度（mg/mL）为横坐标（X），以对照品与内标峰面积的比值作为纵坐标（Y），绘制标准曲线。

α-蒎烯所得回归曲线方程为：Y=9.178X-0.0463，R2=0.9997；实验结果表明进样浓度在0.0218 mg/mL~0.3280 mg/mL范围内具有良好的线性关系。

β-蒎烯所得回归曲线方程为：Y=11.02X-0.0196，R2=0.9994；实验结果表明进样浓度在0.0692 mg/mL~0.6920 mg/mL范围内具有良好的线性关系。

月桂烯所得回归曲线方程为：Y=5.082X-0.034，R2=0.9998；实验结果表明进样浓度在0.0129 mg/mL~0.2580 mg/mL范围内具有良好的线性关系。

柠檬烯所得回归曲线方程为：Y=13.56X-0.0852，R2=0.9996；实验结果表明进样浓度在0.0109 mg/mL~0.2180 mg/mL范围内具有良好的线性关系。

2.3.2 精密度试验精密吸取同一对照品溶液1 μL，按上述2.1项下色谱条件同法进样（n=6），记录α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯与内标物的峰面积比值，并计算RSD值。结果4种对照品峰面积比的RSD依次为1.42%、1.71%、0.95%、1.87%，结果表明精密度良好。

2.3.3 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液1 μL，室温放置，于 0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h 时间点分别进样，记录α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯与内标物的峰面积比值，并计算RSD值。结果4种对照品峰面积比的RSD分别为1.03%，1.34%，1.48%，1.79%。结果表明在12 h内样品溶液稳定性表现良好。

2.3.4 重复性试验取同一样品药材6份，按2.2.2项方法制备供试品溶液，按上述2.1项下色谱条件同法进样 1 μL（n=6），计算 α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和柠檬烯的平均含量分别为 15.47 μg/g，101.50 μg/g，15.86 μg/g，4.74 μg/g；RSD 分别为 1.45%，1.62%，1.28%，1.81%。结果表明重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验选取已知含量的同一样品五味子藤茎粉末，每份约50.00 g，精密称量，分别加入 α-蒎烯 50 μL、β-蒎烯 0.5 mL、月桂烯 50 μL、柠檬烯20 μL上述2.2.3对照品溶液，按2.2.2方法制备，平行操作此过程，制得6份加样回收率试验供试品溶液，按上述2.1项下色谱条件同法进样1 μL测定，计算回收率。实验结果见表1。