鲁燕滨，王玉凤，陈 林，吴红萍

（1.海南伊顺药业有限公司，海南 海口 571127；2.海南国健生物工程有限公司，海南 海口 570125；3.遵义医学院 生物工程系，贵州 遵义 563003；4.海南师范大学 生命科学学院，海南 海口 571158）

两种测定水飞蓟胶囊中水飞蓟素含量方法的比较分析

鲁燕滨1，王玉凤2，陈 林3，吴红萍4*

（1.海南伊顺药业有限公司，海南 海口 571127；2.海南国健生物工程有限公司，海南 海口 570125；3.遵义医学院 生物工程系，贵州 遵义 563003；4.海南师范大学 生命科学学院，海南 海口 571158）

以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法（UV）和高效液相色谱法（HPLC）对利加隆水飞蓟胶囊和GNC水飞蓟胶囊中的总黄酮含量进行分析.结果表明：两种方法可用于测定水飞蓟胶囊中总黄酮含量，简单快速，重现性好.

总黄酮含量；含量测定；紫外分光光度法；高效液相色谱法

中药水飞蓟又名乳蓟子，老鼠筋等，为菊科水飞蓟属草本植物，其全草或果实（种子）可供药用[1].具有清热解毒、保肝护肝、利胆保脑的功能是制造益肝灵、利加隆胶囊、水飞蓟宾胶囊等保肝利胆药的重要原料[2-3].水飞蓟素是从水飞蓟干燥种子中提取精制而得到的黄酮类混合物，主要由3种异构体组成：水飞蓟宾（silybin）、水飞蓟宁（silydianin）、水飞亭（sily⁃christin）[4].水飞蓟素在临床上广泛用于治疗急、慢性肝炎、肝硬化以及肝损伤，随着药理学实验方法的发展和完善，胡帆等发现其还具有抗肿瘤、降血脂、治疗糖尿病等作用[5].随着水飞蓟素药用功能及特殊性能的不断被发现,水飞蓟素的经济价值稳步提高.近年来，国内外有关专家、学者已对水飞蓟素活性成分与药理作用进行了全面系统的研究.早期文献中较多关于水飞蓟宾含量测定的报道，多是以薄层扫描和分光光度法进行，目前对水飞蓟素的主要有效成分的分离测定主要采用薄层色谱扫描法和高效液相色谱法[6-8].由于水飞蓟素主要从水飞蓟种子种提取，多为黄酮类化合物，故一般水飞蓟素含量用总黄酮量计算[9]，但目前有关利用紫外分光光度法和高效液相色谱法测定水飞蓟素（总黄酮含量）比较分析的文献鲜见报道.随着科技的发展，仪器分辨率的进一步提高，紫外分光光度法和高效液相色谱法在药学界的广泛应用，使得药品的定性定量分析更加准确.本研究采用紫外分光光度法和高效液相色谱法测定水飞蓟胶囊中总黄酮含量的方法学进行了相关研究，为评价总黄酮含量的测定方法奠定基础，为建立快速、准确的总黄酮含量测定的方法学提供帮助.

1 仪器试剂与材料

仪器：紫外分光光度计（UV-2550，日本岛津）；高效液相色谱仪（HPLC-2010A，日本岛津）；自动双重纯水蒸馏器（SZ-93，上海亚荣仪器设备有限公司）.

试剂：甲醇（色谱纯，美国Sigma），氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）.

材料：市售利加隆水飞蓟胶囊（德国Madus公司）和GNC水飞蓟胶囊（美国GNC公司）；对照品：芦丁（中国药品生物制品鉴定所）.

2 实验方法

2.1 对照品溶液的制备

精密量取减压干燥至恒重的芦丁对照品10mg于100mL容量瓶中，加75%的甲醇定容至刻度，充分摇匀.取上清液用微孔滤膜器（0.45 um滤膜）过滤，即得芦丁的浓度为0.1mg/mL.

2.2 测定波长的选择

取0.1mg/mL芦丁对照品溶液，以甲醇为空白对照，在200～400 nm的波长范围内扫描，确定芦丁最大吸收波长，绘制芦丁对照品溶液的紫外吸收图谱.

2.3 芦丁对照品标准曲线的绘制

准确量取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL芦丁对照品溶液分别于10mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠6滴，摇匀后静置6 min；加10%硝酸铝6滴，摇匀后静置6 min；加4%氢氧化钠4.0mL；最后加75%甲醇至刻度，摇匀后静置15 min，制备的芦丁对照品浓度分别为0.00、0.02、0.04、0.06、0.08mg/mL，采用紫外分光光度法，以甲醇为空白对照，以芦丁对照品溶液最大吸收波长为检测波长测定其含量，以紫外吸光值为纵坐标，浓度为横坐标制作对照品溶液的标准曲线，并以浓度对吸光值进行线性回归.另外制备0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL对照品溶液，然后用微孔滤膜器（0.45 um滤膜）过滤，采用高效液相色谱法测定其含量，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标制作对照品溶液的标准曲线，并以浓度对峰面积进行线性回归.色谱条件（色谱柱：RH-C18，柱温：30℃，流动相：甲醇-水（40∶60），流速：1mL/min，检测波长：341 nm，进样量：10 uL）.

2.4 样品溶液的制备

2.4.1 紫外分光光度法

分别精密称取利加隆水飞蓟胶囊和GNC水飞蓟胶囊两种药物1.0 g于100mL容量瓶中，加75%的甲醇至刻度，摇匀.准确量取1mL于10mL容量瓶中，然后照标准曲线制备项方法加入显色剂，利加隆水飞蓟胶囊和GNC水飞蓟胶囊终浓度为1mg/mL.

2.4.2 高效液相色谱法

分别精密称取称取利加隆水飞蓟胶囊和GNC水飞蓟胶囊两种药物5mg于100mL容量瓶中，加75%的甲醇至刻度，摇匀.取上清液用微孔滤膜器（0.45 um滤膜）过滤，得两种药物的浓度均为0.05mg/mL.

2.5 样品中水飞蓟素含量的测定

分别采用紫外分光光度法和高效液相色谱法测定加隆水飞蓟胶囊和GNC水飞蓟胶囊样品溶液中水飞蓟素的含量.并进行精密度（连续测定3次）、稳定性试验（放置0 h、12 h、24 h）和重复性试验（3份同一批样品），并分别计算重复性试验、稳定性试验和精密度试验的RSD.

连续测定样品溶液3次进行精密度试验，测定样品溶液放置0 h、12 h、24 h后进行稳定性试，取同一批药物3份，按上述方法配制样品溶液并测定，进行重复性试验.最后分别计算重复性试验、稳定性试验和精密度试验的RSD.

3 结果与分析

3.1 芦丁对照品溶液的最大吸收波长

从图1紫外吸收光谱图可以看出，芦丁对照品溶液在341 nm处具有最大吸收峰.同样在此检测波长下，利用高效液相色谱法测定芦丁对照品溶液时同样出现最高峰.

图1 芦丁对照品溶液的紫外吸收光谱Fig.1 The UV absorption spectrum of rutin solution

3.2 芦丁对照品溶液的标准曲线

根据图3、4的芦丁对照品溶液标准曲线获得的回归方程可以看出，紫外分光光度法和高效液相色谱法测定芦丁对照品溶液分别在0.00～0.08mg/mL和0.02～0.10mg/mL芦丁对照品溶液浓度范围内的相关系数分别为0.998和0.997，说明在该浓度范围内线性关系良好.

图2 芦丁对照品溶液的高效液相色谱图Fig.2HPLC chromatogram of rutin solution

图3 芦丁对照品溶液标准曲线（紫外分光光度法）Fig.3 The standard curve of rutin solution

图4 芦丁对照品溶液标准曲线（高效液相色谱法）Fig.4 The standard curve of rutin solution

3.3 样品溶液的紫外吸收光谱

从利加隆水飞蓟胶囊和GNC水飞蓟胶囊两种药物的紫外光谱图（图5-6）可以看出两种药物均含有黄酮类化合物，且在341 nm波长下均有吸收峰，其含量可利用标准曲线的回归方程计算.

图5 利加隆水飞蓟胶囊的紫外吸收图谱Fig.5The UV absorption spectrum of medicine A

图6 GNC水飞蓟胶囊的紫外吸收图谱Fig.6The UV absorption spectrum of medicine B

3.4 样品溶液的高效液相色谱图

从利加隆水飞蓟胶囊和GNC水飞蓟胶囊两种药物的高效液相色谱图（图7-8）可以看出两种药物在341 nm波长下均有最高吸收峰，且最高峰为水飞蓟素，以该峰的面积作为定量分析，其含量可利用标准曲线的回归方程计算.

3.5 水飞蓟素含量测定结果

由表1可以看出，利用紫外分光光度法和高效液相色谱法测得的利加隆水飞蓟胶囊和GNC水飞蓟胶囊中的水飞蓟素含量存在一定的差异性，利加隆水飞蓟胶囊中的水飞蓟素含量略高于GNC水飞蓟胶囊中的水飞蓟素含量.利用高效液相色谱法测定两种胶囊中的水飞蓟素含量均低于用紫外分光光度法测定的含量，这可能和紫外分光光度法不具备分离功能，测定的含量为所有黄酮类的化合物，并非特指水飞蓟素的含量.

图8 GNC水飞蓟胶囊的高效液相色谱图Fig.8High performance liquid chromatography（HPLC）figure of GNC milk thistle capsules

表1 两种水飞蓟胶囊中水飞蓟素含量测定的结果Tab.1 The results silymarin contents determination of two silymarin capsules by two metheys

3.6 不同方法测定水飞蓟素含量的精密度、重复性及稳定性结果

从表2可以看出，利加隆水飞蓟胶囊和GNC水飞蓟胶囊中水飞蓟素含量测定的两种方法学（UV和HPLC）的精密度、重复性及稳定性的相对标准偏差（RSD）均符合药品检测方法学的要求.药品检测方法学一般规定利用紫外分光光度法和高效液相色谱法检测的精密度、重复性和稳定性的RSD应分别分别控制在2%和1.5%以内，因此两种方法均可用于水飞蓟胶囊中的水飞蓟素含量的测定.

表2 两种水飞蓟素含量测定的方法学考察结果Tab.2Two kinds of methodology for the determination of silymarin contents inspection results

4 讨论

水飞蓟素为黄酮类化合物，其检测大多用薄层色谱法，该方法操作不便，条件要求苛刻，不易控制，并且不能定量[10-12]，本研究分别采用紫外分光光度法及高效液相色谱法两种方法对两种水飞蓟胶囊中总黄酮含量进行测定，结果表明两种检测方法均符合药品检测的相关规定.采用UV法和HPLC法检测总黄酮含量较薄层色谱法方便快捷，既可用于定量分析，也可用于定性分析.

采用紫外分光光度法和高效液相色谱法测定水飞蓟胶囊中的总含黄酮含量结果表明紫外分光光度法的测定值高于高效液相色谱法，其原因在于紫外分光光度法不具备分离功能，测定的是总黄酮的吸光值，即胶囊中所有的黄酮类化合物；而高效液相色谱法兼有分离和测定两种功能，测定的结果是单一组分即水飞蓟素的含量.但就本研究而言，由于水飞蓟胶囊中保肝作用的主要成分是黄酮类化合物[13]，对药物中总黄酮的测定作为制剂的质量指标具有较好的代表性，因此紫外分光光度法在水飞蓟胶囊总黄酮的定量中也显示出非常好的实用价值.因此，本研究采用的两种测定水飞蓟胶囊中总黄酮含量方法均适用于该类产品的检测，具有一定的应用价值.参考文献:

[1]肖莉,王永利,张丽霞,等.水飞蓟素制剂及其应用进展[J].

[2]中国药物与临床,2005,5(3):205-207.刘香臣.水飞蓟素的药理作用与临床评价[J].中国医药

[3]指南,2012,10(14):66-67.孙东,胡仕琦,王宇明.水飞蓟在肝病中的临床应用[J].

[4]2009,25（10）:19-19.常凤岗,董国平,吴知行,等.水飞蓟化学成分的研究[J].南

[5]京药学院学报,1985,16（4）:62-62.胡帆,袁洪,黄志军,等.水飞蓟素的药动学及药物相互作用

[6][J].2009,28（12）:881-885.杨晋,刘雅敏,刘延泽.水飞蓟素药学研究进展[J].天然产

[7]物研究与开发,2004,16（2）:185-187.周采菊,黄华瑞.HPLC法测定水飞蓟素及制剂中水飞蓟

[8]宾的含量[J].中国药品标准,2008,9(3):235-237.吴知行.水飞蓟宾及其水溶性衍生物和制剂含量测定方

[9]法研究[J].南京药学院学报,1981,4（2）:18-18.巫秀美,刘光明,冯玉冰,等.水飞蓟宾类黄酮木质素衍生物

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[11]的测定[J].中国野生植物资料,2002,33（1）:31-33.定天明,天颂九,张正行,等.水飞蓟主要有效成份分离及

[12]分析方法概述[J].中草药,1999,30(8):637-638.张丹,张朝凤,张勉.水飞蓟果实中的黄酮类化合物[J].

[13]药学与临床研究,2011,19（1）:40-43.袁昕蓉,王新,李强,等.水飞蓟素的提取工艺及其在医学上应用[J].中国药业,2009,18（18）:79-79.

责任编辑：黄 澜

Two Methods of Determination of Silymarin Content in Silymarin Capsule of Comparative Analysis

LU Yanbin1，WANG Yufeng2，CHEN Lin3，WU Hongpin4＊
（1.Hainan Yi Shun Pharmaceutical Co.，Ltd，Haikou571127，China；2.Hainan State-Biological Engineering Co.，Ltd.，Haikou571025，China；3.Department of biological engineering，Zunyi Medical College，Zunyi563003，China；4.College of Life Sciences，Hainan Normal University，Haikou571158，China）

In this study,we detected total flavonoids in Silymarin Capsules manufactured in Lijialong and GNC with UV and HPLC as detection methods and rutin as reference substance.UV and HPLC can both be used for the determination of total flavonoids in Silymarin Capsules with good repeatability.They are simple,fast and can have good accuracy in qualita⁃tive and quantitative analysis.

Total flavonoids；Content Determination；UV；HPLC

R 9

A

1674-4942(2015)02-0164-05

2015-02-27

*通讯作者