张威，白艳菊*，文景芝，范国权，高艳玲，申宇，张抒，孟宪欣，王军

病虫防治

马铃薯六种主要病毒通用RT-PCR检测体系的建立

张威1，白艳菊1*，文景芝2，范国权1，高艳玲1，申宇1，张抒1，孟宪欣3，王军4

（1.黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，黑龙江哈尔滨150086；2.东北农业大学农学院，黑龙江哈尔滨150030；3.黑龙江省农业科学院作物育种研究所，黑龙江哈尔滨150086；4.北大荒垦丰种业股份有限公司，黑龙江哈尔滨150090）

马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯M病毒（PVM）和马铃薯A病毒（PVA）是马铃薯生产田中发生率较高、危害较严重的病毒，因此，建立特异性强、灵敏度高、检测速度快的RT-PCR分子检测体系对保障马铃薯种薯质量具有非常重要的意义。试验筛选了6种病毒的特异引物、优化了PCR部分的试剂以及确定了退火温度。结果表明，当Mg2+浓度为2.6 mmol/L、dNTPs浓度为0.1 mmol/L、Taq DNA聚合酶浓度为0.03 U/μL，以及退火温度为55.5℃时反应体系最稳定。最终，建立了一套通用RT-PCR检测体系，只需要变换每种病毒的引物，就可以实现对PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA病毒的RT-PCR检测。每种病毒检测灵敏度均能达到pg以上。

马铃薯；PVX；PVY；PVS；PLRV；PVM；PVA

马铃薯是世界上最重要的粮食作物之一，具有分布范围广、适应性强、产量高、用途广等特点。中国马铃薯的种植面积和总产量均居世界首位［1］，然而整体生产水平却只有马铃薯生产发达国家荷兰平均单产的32%［2］。其中病毒病是降低马铃薯种薯产量，引起种性退化的主要原因。

目前，生产上发生普遍、危害较严重的6种主要病毒有：马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯M病毒（PVM）和马铃薯A病毒（PVA）［3-7］，是马铃薯产业发展的制约瓶颈［8，9］。现阶段对病毒病尚没有有效的治疗办法，只能预防［10］。病毒检测是防治措施中最为重要的环节，也是种薯质量认证的关键指标。

反转录聚合酶链式反应（Reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）是从分子水平上对病毒的RNA进行检测，以其灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点在病毒检测中日益显示出了强大的优势。6种病毒RT-PCR的检测体系都具有独特性，其中PCR部分各试剂用量、退火温度等都具有不同要求，为了提高6种病毒的检测效率，简化操作步骤，通过对每种病毒PCR部分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶浓度工作范围，以及退火温度梯度等试验研究，最终，建立了一套通用RT-PCR检测体系，只需要变换每种病毒的引物，其他试剂用量和程序不变，就可以实现对这6种病毒的检测。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1样品来源

从马铃薯现蕾期到收获期，对内蒙古、黑龙江、吉林、云南等主要马铃薯产区进行样品采集，主要采集花叶、卷叶、坏死、皱缩、矮化等典型病毒病症状或疑似病毒病症状的样品，应用英国ADGEN公司的马铃薯病毒DAS-ELISA检测试剂盒对样品进行PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA检测，阳性样品于-70℃冰箱保存备用，6种病毒的阴、阳性对照由黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所提供。

1.1.2主要试剂

Trizol购自Invitrogen公司；M-MLV反转录酶购自Promeger公司；dNTPs、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、Eco R I、Sal I和pMD18-T均购自TaKaRa（大连）公司；大肠杆菌Escherichia coli GM109由实验室保存；质粒提取试剂盒和DNA片段回收试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯；引物合成及序列测定委托上海生工生物工程有限公司完成。

1.2试验方法

1.2.1引物的筛选

每种病毒从中、英文文献中查找多对引物，筛选出CP（Coat protein，CP）保守区的引物；用Primer Premier 5.0软件进行评价，筛选分值高的引物；然后进行RT-PCR扩增，筛选出只能扩增得到特异性条带的引物，经综合考虑，最终每种病毒筛选1对特异性引物（表1）。

1.2.2总RNA提取

参照TrizolReagent（InvitrogenTM）说明书，并在此基础上进行改进：将样品置于研钵中，加液氮研磨成粉末，转至1.5 mL离心管，加入1 mL Trizol混匀，使其充分裂解；4℃、14 000 r/min离心5 min；取上清，加入200μL三氯甲烷，振荡混匀，室温放置15 min；4℃，12 000 r/min离心15 min；吸取上层水相至新1.5 mL离心管中，加入0.5 mL异丙醇，混匀，室温放置10 min；4℃、12 000 r/min离心10 min；弃上清，留沉淀，加入1 mL 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；4℃、7 500 r/min离心5 min，弃上清，将离心管倒置于滤纸上，自然干燥；加入25～100μL DEPC水溶解沉淀，即得到RNA。

1.2.3提取RNA质量的检测

用紫外分光光度计测定其吸光度值，鉴定总RNA的纯度。

1.2.4RT-PCR

反转录体系：取2.5μL RNA，65℃加热8 min，冰上放置2 min；再加入下游引物（100 ng/μL）0.5μL，5 3 5 CVGGFS 1μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1μL，RNase Inhibitor5 U，M-MLV反转录酶100 U，用ddH2O补足至10μL，短暂离心。反应程序：42℃反应1 h，92℃灭活2 min，-20℃保存待用。

PCR反应体系：取2μL cDNA，10 1 3 buffer 2.5μL，上、下游引物（100 ng/μL）各0.5μL。分别对6种病毒反应体系中的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶浓度进行优化：dNTPs浓度选择在0.1～0.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶浓度选择在0.01～0.05 U/μL，Mg2+浓度选择在1.0～3.7 mmol/L。

PCR反应程序：92℃预变性5 min；92℃变性30 s，退火温度设定49.0～60.3℃、30 s，72℃延伸45 s，循环30次；72℃延伸8 min。

1.2.5PCR产物的检测、克隆与测序

反应结束后，取5μL扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L的溴化乙锭）电泳检测。用Bio-Rad凝胶成像系统观察结果。

RT-PCR产物纯化后分别连接到pMD18-T载体上，转化到GM109感受态细胞中。挑取的抗性单菌落扩繁后，试剂盒提取质粒，再应用Eco R I和Sal I对重组质粒进行酶切鉴定。目的片段进行测定，采用DNAstar软件进行序列分析。

表1　病毒特异性引物Table 1 Specific primers of viruses

表2　RNA的紫外吸收值Table 2 Ultraviolet absorption value of RNA

2　结果与分析

2.1总RNA提取质量

试验采用Trizol法提取总RNA，为保障RT-PCR检测结果准确，必须使用纯度较高、完整性较好的RNA。从表2可以看出，试验提取的总RNA OD260/OD280比值均为1.80～1.90，表明植物组织中的酚类化合物、多糖和蛋白质等已基本去除，总RNA纯度较理想。

2.2PCR部分试剂浓度确定

通过分别对PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA6种病毒PCR部分的Mg2+（1.0～3.7 mmol/L）、dNTPs（0.1～0.5 mmol/L）、Taq DNA聚合酶（0.01～0.05 U/μL）进行单因子工作浓度确定。经反复试验，最终确定当dNTPs浓度在0.1 mmol/L、Mg2+浓度在2.6 mmol/L、Taq DNA聚合酶浓度在0.03 U/μL时，6种病毒的RT-PCR均能达到检测稳定的状态，而且应用一套通用RT-PCR检测体系，只需要变换每种病毒的引物，就可以实现对这6种病毒进行检测，提高了检测效率，简化了操作步骤且达到节约成本的目的。

2.3RT-PCR反应程序退火温度确定

通过分别对PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA6种病毒RT-PCR退火温度梯度的试验，确定了每种病毒的退火温度范围，从表3可以看出，退火温度在51.9～58.6℃时，6种病毒都能扩增得到目的片段，最终选择中间值55.5℃为体系的退火温度。

2.46种病毒通用RT-PCR检测体系的建立

通过对6种病毒PCR部分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶浓度工作范围，以及退火温度梯度等试验，最终建立了一套通用RT-PCR检测体系（表4）。

表3　6种病毒的退火温度范围Table 3 Annealing temperature range of six viruses

表4　PCR反应体系Table 4 PCR reaction system

分别以感染病毒的马铃薯叶片总RNA为模板，对6种病毒分别进行RT-PCR扩增。从图1看出，泳道2，3，4，5，6和7分别扩增得到长度为273 bp，336 bp，447 bp，520 bp，711 bp和729 bp的6条特异性条带，而阴性对照无此条带，成功扩增得到PVA、PLRV、PVY、PVM、PVX和PVS病毒。

2.5RT-PCR产物的克隆与序列测定

将6种病毒的RT-PCR扩增产物纯化后，克隆到pMD18-T载体上，试剂盒提取质粒，对重组质粒的插入片段进行序列测定，测序结果用DNAstar软件分析，分析结果显示：PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA的扩增产物分别由711，447，729，336，520和273个核苷酸组成，与预期片段大小相同，序列与相应病毒序列同源性均在98.5%以上，证明RT-PCR检测结果准确。

2.6通用RT-PCR检测体系的灵敏度

提取PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA病毒的RNA，紫外分光光度计测定RNA的浓度依次为921.30 ng/μL，1 120.50 ng/μL，605.75 ng/μL，160.35 ng/ μL，66.78 ng/μL和561.00 ng/μL，每一种病毒的RNA经过浓度梯度稀释后再进行RT-PCR扩增，结果见表5，经计算6种病毒的RT-PCR检测体系最低能检测出RNA浓度分别为368 pg/μL，448 pg/μL，303 pg/ μL，107 pg/μL，66 pg/μL和374 pg/μL。

2.7应用RT-PCR检测体系对马铃薯田间样品进行检测

分别应用PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA 6种病毒RT-PCR检测体系对已知带毒情况的田间采集的马铃薯病叶和脱毒试管苗进行检测，RT-PCR检测结果非常准确。图2为代表性样品的电泳图。

3　讨论

PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA是马铃薯生产田中发生率较高、危害较严重的病毒，也是国家标准《马铃薯种薯》（GB18133-2008）中规定的马铃薯种薯必须检测的病毒。目前马铃薯质检单位和科研机构主要采用血清学DAS-ELISA方法进行病毒检测，此方法虽适合样品量较大的田间样品的检测，但不适用于病毒浓度较低的马铃薯脱毒试管苗和休眠薯块的检测，马铃薯试管苗作为源头，其脱毒是否彻底关系到各级种薯的质量，因此，需要配套更灵敏的检测技术。近年来，RT-PCR检测技术以其灵敏度高、特异性强、检测速度快等特点在病毒检测上得到应用，可以弥补DAS-ELISA检测方法的不足，对试管苗、休眠薯块等样品都可以进行准确检测。

图1　马铃薯六种病毒通用RT-PCR检测体系的建立Figure 1 Establishment of RT-PCR detection system for six potato viruses

表5　通用RT-PCR检测体系的灵敏度Table 5 Universal RT-PCR detection system sensitivity

图2　应用RT-PCR对马铃薯田间样品的检测Figure 2 Detection of potato field samples using RT-PCR

通过分别对6种病毒引物筛选、PCR部分各试剂工作浓度以及每种病毒退火温度确定，最终建立一套通用RT-PCR分子检测体系，只需要变换每种病毒的引物，就可以实现分别对PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA病毒的RT-PCR检测。在RT-PCR反应体系中，引物的选择对试验的成败起关键性作用［18］，既要使引物能对病毒进行特异性扩增，又要使引物能对同一病毒的不同株系进行特异性扩增，以保障不漏检病毒。本研究从中、英文文献中每种病毒查找多对引物，首先在GenBank上将每种病毒不同分离物的CP基因进行多序列比对，筛选出在保守区的引物，然后用Primer Premier 5.0软件进行综合评价，筛选效果好的引物，然后再用RT-PCR体系扩增，筛选出能扩增得到特异性条带而无杂带的引物，最终每种病毒筛选到一对特异性引物。其次，PCR部分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶浓度对试验成败起关键作用，经反复试验，最终确定当dNTPs浓度在0.1 mmol/ L、Mg2+浓度在2.6 mmol/L、Taq DNA聚合酶浓度在0.03 U/μL时，6种病毒的RT-PCR均能达到检测稳定的状态。再次，PCR反应程序中退火温度对反应的影响很大，通过对每种病毒RT-PCR退火温度梯度进行试验，确定了退火温度在51.9～58.6℃6种病毒都能扩增得到目的片段，最终选择中间值55.5℃为体系的退火温度。

本研究还对6种病毒RT-PCR检测体系的灵敏度进行了测定，对每一种病毒的RNA经过浓度梯度稀释后再进行RT-PCR扩增，经计算6种病毒的RT-PCR检测体系最低能检测出RNA浓度分别为368 pg/μL，448 pg/μL，303 pg/μL，107 pg/μL，66 pg/μL和374 pg/μL，均达到pg以上。

最后，分别应用PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA 6种病毒通用RT-PCR检测体系对已知带毒情况的田间采集的马铃薯病叶和脱毒试管苗进行检测，RT-PCR检测结果非常准确，但对病毒含量较低的脱毒试管苗来说，RT-PCR检测的灵敏度更高，因此该体系完全可以应用于马铃薯上述6种病毒的田间检测。

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Establishment of UniversalRT-PCR System for Detection of Six Major Potato Viruses

ZHANG Wei1,BAIYanju1*,WEN Jingzhi2,FAN Guoquan1,GAO Yanling1,SHENYu1, ZHANG Shu1,MENG Xianxin3,WANG Jun4
(1.Institute of Virus-free Seedling Research,Heilongjiang Academy of AgriculturalSciences,Harbin,Heilongjiang 150086,China; 2.College ofAgronomy,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin,Heilongjiang 150030,China;3.Institute of Crop Breeding, Heilongjiang Academy ofAgriculturalSciences,Harbin,Heilongjiang 150086,China;4.Beidahuang Kenfeng Seed Limited Company,Harbin,Heilongjiang 150090,China)

The higher incidence and more serious viruses in potato fields are potato virus X(PVX),potato virus Y (PVY),potato virus S(PVS),potato leafrollvirus(PLRV),potato virus M(PVM),and potato virus A(PVA),so it is very importantto guarantee the quality ofseed potato by establishmentof RT-PCRmolecular detection system with specificity, high sensitivity and fastdetection speed for these viruses.In this research,the primer for each virus was screened,PCR reagents were optimized,and annealing temperature was determined.The results indicated thatwhen the concentration of Mg2+was 2.6 mmol/L,d NTPs was 0.1 mmol/L,Taq DNA polymerase was 0.03 U/μL,and annealing temperature was 55.5℃,the reaction system was the most stable.Finally,a universalRT-PCR detection system was established,which only need to change primer for each virus when the RT-PCR detection for PVX,PVY,PVS,PLRV,PVM and PVA was needed.The detection sensitivity ofeach virus could reach the levelofpg.

potato;PVX;PVY;PVS;PLRV;PVM;PVA

S532

A

1672—3635（2015）04-0222-06

2014-12-20

黑龙江省自然科学基金项目（C201234）；黑龙江省农业科技创新工程重点资助项目（2012ZD015）；现代农业产业技术体系专项资金资助（CARS-10-P14）；国家科技支撑项目（2012BAD06B02-02C2）。

张威（1981-），女，助理研究员，硕士，研究方向为分子植物病理学。

（Corresponding author）：白艳菊，研究员，研究方向为分子植物病理学，E-mail：yanjubai@163.com。