李慧影，马亚珂，杨　岳，王　虹

·实验研究·

汉黄芩素上调小鼠骨髓Lin-细胞Pecam1基因表达*

李慧影，马亚珂，杨岳，王虹

（天津中医药大学中医药研究院，天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，天津300193）

［目的］探讨汉黄芩素对小鼠骨髓Lin-细胞增殖、分化、迁移、黏附关键功能基因表达的影响。［方法］采用免疫磁珠法分离小鼠骨髓Lin-细胞，采用CD117作为标志进行细胞鉴定。应用实时定量聚合酶链式反应（RT-PCR）芯片技术研究汉黄芩素对小鼠骨髓Lin-细胞功能基因表达的影响。采用黏附能力测定实验观察Lin-细胞的黏附能力。［结果］流式细胞技术结果显示，小鼠骨髓源性单个核细胞免疫磁珠分选后CD117的阳性率为93.7%；芯片结果发现汉黄芩素明显上调Lin-细胞血小板内皮细胞黏附分子-1（Pecam1）基因表达；黏附能力测定实验结果可见汉黄芩素增强Lin-细胞的黏附能力。［结论］免疫磁珠法分离小鼠骨髓Lin-细胞是一种较为理想的分离方法；汉黄芩素可能通过上调小鼠骨髓Lin-细胞Pecam1基因表达，从而增加Lin-细胞的黏附能力。

小鼠骨髓Lin-细胞；汉黄芩素；关键功能基因；黏附能力

骨髓包含不同种类的干祖细胞，如造血干细胞（HSCs）、内皮祖细胞（EPCs）以及间充质干细胞（MSCs）［1］。干细胞的表面标记素有争议，并且不同部位的细胞标记也不相同［2-6］。

在骨髓，Lin-被认为是血液血管干细胞的基本特征。血液血管干细胞是一类具有双向分化潜能的祖细胞，可以分化成为造血干细胞和内皮祖细胞（EPCs）［7］。同时还表达Flk+、Sca-1+、c-kit＋（CD117）的细胞具有很强的血管再生功能，被称为EPCs［8-9］，进入组织后开始表达成熟内皮标志如血管内皮细胞钙依黏连蛋白（VE-cadherin）和E-选择素（E-selectin）。EPCs通过动员，归巢，迁移，分化，增殖，黏附等生物活性作用，促进血管新生［10］。近几年来实验研究发现一些中药单体能够有效促进离体内皮祖细胞的黏附、趋化和增殖能力，但作用机制尚不清楚［11-12］。现阶段研究较多且较成熟的是中药对MSCs的干预作用［13-14］。

汉黄芩素（wogonin）是一种重要的黄酮类化合物，具有广泛的生物活性。本研究观察了汉黄芩素对小鼠骨髓Lin-细胞功能基因表达的影响，旨在探讨汉黄芩素对Lin-细胞增殖、分化、迁移、黏附能力是否有影响。

1　材料和方法

1.1实验动物、主要试剂与仪器10～12周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠，每只约20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

胎牛血清、胰蛋白酶液（Biological Industries）；小鼠外周血淋巴细胞分离液、红细胞裂解液、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液、0．5 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（Solarbio）；Linege Cell Depletion Kit、PE－CD117抗体（Miltenyi Biotec）；High Pure RNA Isolation Ki（tRoche）；TaqManReverse Transcription Rengents、TaqMan?Gene Expression Master Mix、基因芯片（Applied Biosystems）；EGM－2（Lonza Clonetics）；Vitronectin、Gelatin（Sigma）；流式细胞仪（BD公司）；倒置荧光显微镜（Nikon公司）；MiniMACS Separator、MS Columns（Miltenyi Biotec）；ABI PRISM 7500（Applied Biosystems）；PCR C1000（BIO－RAD公司）。

1.2方法

1.2.1Lin-细胞的分离颈椎脱臼法处死C57BL/6小鼠，浸泡75%乙醇中消毒10 min，超净台中无菌分离双侧股骨和胫骨，尽量剔除附着的肌肉和脂肪组织。将骨头浸泡在D-Hank’s中，用D-Hank’s冲洗骨髓，直到冲洗液澄清为止，通过70 μm的细胞过滤器将骨髓冲洗液转移至50 mL离心管中。以小鼠外周血淋巴细胞分离液经密度梯度离心法获得单个核细胞。悬浮细胞进行细胞计数，然后根据细胞数目计算出需加入的Linege Cell Depletion试剂的量进行磁性标记并选择合适的分选柱。磁性标记后，离心弃去上清，用缓冲液［由磷酸盐缓冲液（PBS）、0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）组成，需提前一天配制］悬浮细胞。平衡柱子后，底部放阴性收集管，将标本细胞悬液加入柱中，用缓冲液清洗柱子3次（每次缓冲液与细胞悬液等量），阴性收集管中所得液体即为Lin-细胞。离心弃上清，用EGM-2全培基悬浮细胞，放置37℃、5%二氧化碳（CO）2孵箱中进行培养。

1.2.2Lin-细胞的鉴定细胞培养24 h后，胰蛋白酶液进行消化，300×g下离心10 min收集细胞，缓冲液洗去胰蛋白酶液。100 μL缓冲液重悬细胞，加入10 μL PE-CD117抗体，2～8℃下避光孵育10 min。加入适量缓冲液洗去未结合的抗体，流式细胞仪检测PE-CD117的表达。

1.2.3汉黄芩素对Lin-细胞关键功能基因表达的影响Lin-细胞分选出来后，分别向细胞中加入二甲基亚砜（DMSO）和终浓度为10-5mol/L的汉黄芩素。孵箱中孵育8 h后，采用High Pure RNA Isolation Kit提取总RNA，采用TaqManReverse Transcription Rengents试剂盒将总RNA反转录为cDNA（20μL体系），取反转录产物cDNA模板2.5μL，按照TaqManGene Expression Master Mix试剂盒说明书进行实时定量PCR，测定Lin-细胞中基因相对表达量。采用2-ΔΔCt方法对实时定量PCR结果进行分析。功能基因的种类、符号及基因名见表1。

1.2.4汉黄芩素对Lin-细胞黏附能力的影响Lin-细胞分选出来后，分别向细胞中加入DMSO和终浓度为10-5mol/L的汉黄芩素。孵箱中孵育24 h后，各组细胞胰酶消化收集，以浓度为1×104个细胞/孔接种在2.5 μg/mL Vitronectin和0.5%gelatin包被的96孔板内，孵育1 h，去除非贴壁细胞，4%多聚甲醛固定贴壁细胞，DAPI染色，显微镜下计数，取8孔平均值，比较各组药物对Lin-细胞黏附能力的影响。

2　结果

2.1汉黄芩素促进Lin-细胞的黏附能力与空白组比较，汉黄芩素浓度为10-5mol/L时对Lin-细胞的黏附能力有促进作用（P<0.01），见图1。

表1　功能基因的种类、符号及基因名

2.2汉黄芩素上调Lin-细胞Pecam1基因表达以芯片技术研究汉黄芩素对Lin-细胞功能基因表达的影响，研究发现汉黄芩素上调Lin-细胞Pecam1基因表达7倍左右，见图2、图3。

2.3流式鉴定结果流式分析结果表明，小鼠骨髓源性单个核细胞免疫磁珠分选后CD117的阳性率为93.7%，见图4，证实得到了高纯度的Lin-细胞。

3　讨论

Lin-是小鼠造血细胞常用表型之一，Lineage系列包括 CD3、CD4、CD8、B220、Gr1、Ter119、CD11b及IL-7R。CD3，CD4，CD8是T细胞的标记；B220表达于B系细胞；Gr1是粒细胞的标记；Ter119主要表达在红细胞上；CD11b表达于巨噬细胞、自然杀伤（NK）细胞和活化的淋巴细胞；L-7R主要表达于骨髓中未成熟的B细胞［15］。Lineage系列主要表达于骨髓成熟细胞，通过Lineage-分选可去除成熟细胞。Lin-细胞同时还表达Flk+、Sca-1+、c-kit+的细胞具有很强的血管再生功能，被称为EPCs。血液循环中含有的EPCs不仅能参与形成新的血管，并且能存在于血管新生活跃的部位［16］。EPCs在分化过程中自身分泌细胞因子，这些因子均能特异性地作用于血管内皮细胞，刺激其增殖，促进血管新生，从而改善缺血心肌的血液供应［17-18］。

图1　汉黄芩素对Lin-细胞黏附能力的影响

图2　汉黄芩素对Lin-细胞Pecam1基因表达的影响

图3　汉黄芩素对Lin-细胞功能基因表达的影响

图4　Lin-细胞表型鉴定

免疫磁性细胞分选系统（MACS）是一种集免疫学、细胞生物学、磁力学等为一体的高度特异性细胞分选技术，其高度特异性来自抗体对抗原的特异性识别［19］。研究表明［20］，MACS是分选效率最高的系统，其具有快速、高效、不影响细胞功能、操作简便、纯度及得率高等特点，已广泛应用于基础和临床研究。而探针法定量PCR技术由于其准确性也已在科研领域得到更为广泛的应用。本研究参照相关文献分选出单个核细胞后［21-22］，选用了MACS技术得到高纯度的Lin-细胞，继而应用PCR芯片技术，筛查药物对骨髓干/祖细胞功能基因的影响，将细胞分选技术的特异性、定量PCR技术的准确性和芯片技术的高通量相结合，既保证了细胞的干/祖细胞特征，又满足了PCR芯片技术对细胞量的需求，从而达到筛查药物作用靶点的目的。

本实验选择了38个与Lin-细胞增殖、凋亡、迁移、分化、动员、归巢、黏附功能相关的基因见表1，应用实时定量PCR芯片技术研究发现在上述基因中汉黄芩素能够显著上调Lin-细胞Pecam1基因表达。

Gigant等［23］研究发现黏附分子及其受体的表达能够调控祖细胞的动员和归巢。本实验发现汉黄芩素能够显著上调Lin-细胞Pecam1基因表达，而Pecam1是存在于血管内皮细胞、血小板以及白细胞表面的一种黏附分子，参与和调节单核细胞与内皮细胞的黏附及迁移［24］。但是Pecam1的受体及其是否影响祖细胞的动员和归巢尚没有文献报道。

天然产物汉黄芩素具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗炎、神经保护、抗肿瘤和抗病毒活性等，多数研究也是从以上几个方面开展。也有文献报道汉黄芩素对肺腺癌A549细胞中黏附、迁移相关基因有影响［25］，但汉黄芩素对干/祖细胞是否有作用尚没有文献报道。故笔者用汉黄芩素对Lin-细胞的功能基因进行筛查，发现汉黄芩素能够明显上调Lin-细胞的黏附基因Pecam1的表达。

通过以上研究，结果发现免疫磁珠法分离小鼠骨髓Lin-细胞是一种较为理想的分离方法，汉黄芩素可能通过上调小鼠骨髓Lin-细胞Pecam1基因表达，从而增加Lin-细胞的黏附能力，因此可以推测汉黄芩素对干/祖细胞的动员、归巢有影响，但需进一步验证。同时，此研究提示应采用更多的细胞标记物研究药物对EPCs作用及对药物的载体机制进一步研究。

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Regulated Pecam1 gene expression in bone marrow-derived Lin-cells by wogonin

LI Hui-ying，MA Ya-ke，YANG Yue，WANG Hong
（Research Institute of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To explore the effects of wogonin on the proliferation，differentiation，migration，adhesion gene expression of bone Marrow-derived Lin-cells.［Method］Using magnetic activated cell sorting（MACS）to separate Lin-cells from bone marrow and using CD117 as a marker for cell identification.To investigate the effect of wogonin on functional gene expression of bone marrow-derived Lin-cells by real-time-RT-PCR array technology.Adhesion method was used to detect the effect of wogonin on the adhesion of Lin-cells.［Result］Flow cytometry results showed that，mononuclear cells derived from bone marrow of mice after MACS，the separation rate of CD117 was 93.7%.The PCR chip results showed that the gene expression of platelet endothelial cell adhesion molecule-1（Pecam1）of Lin-cell was significantly up-regulation by wogonin.The adhesion ability experimental result showed that wogonin could enhance the adhesion ability of Lin-cells.［Conclusion］It is an ideal separation method by using MACS to separate Lin-cells from bone marrow.Wogonin may up regulate Lin-cells in bone marrow of mice Pecam1 gene expression，thereby increasing the adhesion ability of Lin-cells.

bone marrow-derived Lin-cells；wogonin；key functional gene；adhesion ability

R285.5

A

1673－9043（2015）02－0086-05

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.02.06

国家自然科学基金面上项目（81173592）；新世纪优秀人才支持计划（NCET-13-0935）；长江学者和创新团队发展计划资助（IRT0973）。

李慧影（1989-），女，硕士研究生，研究方向为中医药治疗缺血性心脏病，心血管药理。

王虹，E-mail：wanghongsys@126.com。

（2014-11-14）