方红娟，冯 琼，王 强，张 强，史云湘，陈金龙*，钟历勇*

(1.首都医科大学附属北京天坛医院内分泌科，北京100050;2.军事医学科学院疾病预防控制所，北京100010)

胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是引发2型糖尿病的始发因素，其机制是预防和治疗2型糖尿病的关键。IR是指骨骼肌、脂肪组织、肝脏等胰岛素靶器官对胰岛素的敏感性下降，进而产生葡萄糖(glucose，GLU)的代谢能力障碍，是引起一些代谢性疾病的主要因素之一［1］。鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SPK1)是鞘磷脂代谢中的一个关键酶，研究表明SPK1能够降低2型糖尿病KK-Ay小鼠的血糖，改善胰岛素抵抗［2］。高胰岛素血症对诱导胰岛素抵抗起重要调节作用，肝脏胰岛素抵抗可诱发高血糖［3］。SPK1催化产物1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)是一个重要的活性脂质分子，其对肝细胞IR糖代谢的研究目前尚无报道。本实验观察S1P对人肝细胞胰岛素抵抗模型糖代谢的影响，以期为糖尿病的发病机制及药物开发提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝细胞株(LO2)(北京友谊中联生物科技有限公司);RPMI1640培养液(Gibco公司);胎牛血清(Hyclone公司);牛胰岛素、SPK1抗体、S1P和二氯荧光素探针(Sigma公司);油红O染液(南京建成科技有限公司);线粒体标记荧光探针(Molecular Probes公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及IR模型建立:LO2细胞复苏后用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。当细胞增殖到80%汇合度的时候，弃培养液，用PBS冲洗贴壁细胞，除去培养瓶中残留的血清，然后用0.25%胰蛋白酶消化，每5天传代1次，每次按1∶3比例传代。取对数期的LO2细胞，按照1×105个细胞/孔接种于24孔板中，每孔500 μL。待细胞贴壁增殖到80%左右汇合时，分别加入 10、50、100、500 和1 000 nmol/L的胰岛素(insulin，INS)，然后在 12、24、36、48和60 h后更换新鲜的培养液，培养2 h后进行检测。同时，随机选取4个1 000 nmol/L INS诱导组，在以上实验条件下培养48 h后，分别加入0、0.5、1.0、5.0 μmol/L 的 S1P，继续培养 10 和30 min后进行检测。

1.2.2 MTT检测细胞活力:将LO2细胞按103～104个细胞∕孔接种96孔板中，待细胞贴壁，长满80%左右，倒掉培养液，分别按 10、50、100、500 和1 000 nmol/L的浓度加入用RPMI1640培养液稀释的INS，每孔200 μL，不加INS组为对照组，每组另设一个空白对照组，即没有细胞只加培养液，共8个平行对照组。继续培养48 h，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，继续孵育4～6 h，倒掉上清，每孔加入DMSO溶液150 μL。在490 nm波长下测每孔吸光度A490值。

1.2.3 葡萄糖-己糖激酶法检测GLU含量:细胞培养一定时间后，取上清液，4℃、2 000 r/min离心1 min去沉淀，应用多功能自动生化仪葡萄糖-己糖激酶法检测GLU含量。

1.2.4 油红O染色鉴定细胞脂肪变性:用10%甲醛固定细胞30 min，油红O染液按5∶2体积比稀释，滤纸过滤后，每孔缓慢加入3 mL染液，染色10 min后，倒掉染液，用去离子水漂洗细胞1 min左右，去除杂质，然后用苏木精染液染色10 s，倒去染液，用去离子水漂洗30 s。在倒置显微镜下观察染色结果并拍照。

1.2.5 荧光染色检测细胞ROS:培养板细胞用PBS冲洗3次，加入RPMI1640培养液稀释的二氯荧光探针5 μmol/L，线粒体标记荧光探针 500 μmol/L，每孔1.5 mL，共同孵育40 min，倒掉上清液，再用PBS冲洗细胞3次，在倒置显微镜下观察并拍照，蓝色荧光强度代表活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成情况，绿色荧光显示的是细胞线粒体。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达:提取各组细胞总蛋白，每孔加样10 μg，经SDS-PAGE电泳分离，用300 mA电流湿转方法转至硝酸纤维素膜膜上。用5%脱脂牛奶封闭1 h，SPK1抗体按照1∶1 000稀释，4℃孵育过夜，洗膜后，再用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h，采用增强型发光液，暗室显影曝光。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度INS溶液对LO2细胞增殖的影响及培养液中残存GLU浓度变化

不同浓度的INS对细胞的增殖无影响。不同浓度INS作用细胞48 h后，与对照组相比，50和500 nmol/L INS组培养液中GLU含量均显著下降(*P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01)，10、100 和 1 000 nmol/L INS组细胞的GLU吸收能力无显著变化(表1)。

表1 不同浓度INS溶液对LO2细胞增殖的影响及细胞上清中GLU含量变化Table 1 Effects of different levels of insulin on cell proliferation and the glucose levels(x ± s，n=8)

2.2 INS刺激细胞不同时间后培养液残存GLU浓度

1000nmol/L INS作用LO2细胞24 h后，细胞吸收GLU的能力开始增加(表2);36 h后，吸收GLU能力显著增加(P＜0.01);在48 h后，GLU浓度开始上升，细胞吸收GLU能力下降，与36 h相比有显著性差异(P＜0.05);60 h后，细胞吸收GLU的能力比48 h显著增加(P＜0.01)。对100 nmol/L INS组也做了不同时间GLU浓度检测，结果均无显著差异。

表2 1 000 nmol/L的INS溶液作用不同时间细胞上清中GLU含量Table 2 The glucose levels in different time after 1 000 nmol/L insulin induced(x ± s，n=6)

2.3 油红O染色技术检测细胞内脂滴产生量

油红O能特异性使脂肪组织或细胞中的脂质着色。图1提示，油红O染色后，胞质内的脂滴呈现红色颗粒形状，分布在细胞膜周围。与对照组相比，不同浓度的INS作用LO2细胞后，胞质内的脂滴颜色加深，面积也有不同程度的增大。其中1 000 nmol/L的INS组细胞胞质内红色部分的面积最大，颜色也最深。

2.4 模型组细胞总ROS和线粒体ROS变化

经二氯荧光探针处理后，细胞中产生的ROS呈现为绿色，图2中可以看到IR模型组产生的ROS要比对照组明显增多，模型组氧化损伤程度显著高于对照组;经线粒体红色荧光探针处理后，细胞中的线粒体呈现为红色。两图重叠以后，图中的黄色部分即来自线粒体的ROS，可以观察到模型组的线粒体ROS比对照组显著增多。

2.5 不同浓度的INS诱导细胞后SPK1蛋白表达变化

用不同浓度的INS作用LO2细胞48 h后，与对照组相比，模型组细胞SPK1蛋白表达量明显增多;随着INS浓度的增大，SPK1蛋白的表达量呈递增趋势，其中1 000 nmol/L INS组的SPK1蛋白表达量最多(图3)。

2.6 S1P对胰岛素抵抗模型组细胞血糖吸收的影响

图1 不同浓度INS素溶液作用LO2细胞48 h后油红O染色结果Fig 1 The oil red O staining of LO2 cells after 48 hours induced by different levels of insulin(×200)

在模型组细胞中分别加入0、0.5、1.0和5.0 μmol/L S1P后，在10和30 min检测培养液中GLU的浓度。随着S1P浓度的增大，模型组细胞吸收GLU的能力呈递增趋势。与对照组相比，0.5 μmol/L组细胞吸收GLU无显著变化，1.0和5.0 μmol/L组细胞的吸收均有显著增加(P＜0.01)，并且这两组之间也有显著性差异(P＜0.01)(表3)。

3 讨论

图3 Western blot检测不同浓度INS下LO2细胞SPK1蛋白表达情况Fig 3 Expression of SPK1 protein in LO2 cells induced by different levels of insulin

目前，针对IR产生机制的研究日益受到医学界的重视，而建立合理的IR模型是解决这些难题的基础。体外建模的实验手段主要采用游离脂肪酸、高糖、三酰甘油、肿瘤坏死因子-α和INS作为诱导剂，研究对象主要有3T3-L1小鼠脂肪细胞、人肝胚胎瘤细胞和人正常肝细胞等。肝细胞上密集分布着INS受体，参与维持体内糖脂代谢平衡，对INS促进GLU的摄取作用极为敏感，且肝肿瘤细胞本身就有IR作用［4-6］。相比较之下，采用人正常肝细胞LO2作为研究对象建立IR模型更可靠。也有人将LO2细胞作为研究对象，用高浓度INS诱导建立IR模型［7］，但诱导模型的最佳INS浓度和诱导时间却不完全不同。

本实验中，通过胰岛素体外诱导法来确定LO2细胞胰岛素抵抗的最佳作用浓度及时间。实验结果显示，100和1 000 nmol/L INS作用48 h后细胞的葡萄糖吸收最低，故初步选择100和1 000 nmol/L INS做为IR的诱导浓度。在作用36 h后，1 000 nmol/L INS的降糖作用最为明显，而48 h后胰岛素的降糖作用却显著下降，提示细胞产生胰岛素抵抗。在同样作用时间内，100 nmol/L INS未出现显著的改变，因此最终选择1 000 nmol/L INS作用48 h为胰岛素抵抗发生模型。长期IR会引发一系列代谢性疾病，如肥胖、脂肪肝和脂代谢紊乱等，是引起非酒精性脂肪肝和慢性肝脏疾病的最常见原因［8］。因此，推测产生IR的LO2细胞可能存在不同程度的脂肪变性。油红O染色实验结果显示，1 000 nmol/L INS组细胞中脂滴增多明显。线粒体氧化应激与2型糖尿病IR发生和发展有着密切的联系［9］。在2型糖尿病患者体内，ROS生成过多或氧化-抗氧化系统失衡，可导致细胞内生物大分子的氧化损伤，引起细胞功能障碍甚至凋亡［10］。荧光双染方法结果表明，模型组线粒体ROS明显比对照组多。Western blot结果提示，不同INS浓度的培养液诱导下，SPK1的表达变化与INS的刺激有关，S1P可增加IR细胞摄取葡萄糖能力、改善糖代谢。因此，推测SPK/S1P通路可能参与胰岛素抵抗机制的糖代谢，而其对血糖的调节以及糖代谢密切相关信号分子的影响将是下一步研究的重点方向。

表3 不同浓度的S1P溶液作用细胞不同时间后细胞上清中葡萄糖含量Table 3 The glucose levels in different time induced by different levels of S1P(x ± s，n=6)

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