“活血开窍汤”对MCAO模型大鼠血脑屏障通透性的时效性影响*

2015-08-25赵金生孟凡征

天津中医药 2015年11期

赵金生，孟凡征，殷　韵，李　平

赵金生1，2，孟凡征1，殷韵2，李平3

（1.天津市南开医院脑病科，天津300100；2.天津医科大学，天津300070；3.天津市第三中心医院，天津300170）

［目的］探讨“活血开窍汤”不同给药时间对大脑中动脉梗死（MCAO）模型大鼠神经功能恢复及血脑屏障的时效性影响。［方法］将48只MCAO模型Wistar大鼠随机分为模型组及活血开窍汤治疗组（Ⅰ组：造模后2 h给药组；Ⅱ组：造模后24 h给药组；Ⅲ组：造模后48 h给药组），每组12只，另有12只大鼠作为假手术组。采用Zealonga评分法观察各组大鼠神经功能缺损情况，取材前2 h于尾静脉注射伊文思蓝（EB）溶液以观察各组大鼠血脑屏障（BBB）的通透性，免疫组化法观察各组大鼠脑组织Claudin-5蛋白含量情况。［结果］各治疗组大鼠神经功能较模型组均有改善，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。活血开窍汤Ⅱ、Ⅲ组大鼠脑缺血侧纹状体EB含量低于模型对照组（P＜0.05），Claudin-5蛋白含量相对较高（P＜0.05）。而活血开窍汤Ⅰ组与模型对照组相比，活血开窍汤Ⅱ组与Ⅲ组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。［结论］活血开窍汤可通过减轻BBB通透性，减少Claudin-5蛋白的破坏从而保护MCAO大鼠血脑屏障，但在急性期对BBB的保护作用并不十分明显，且尚不能证明在非急性期越早给予活血开窍汤对BBB的保护作用就越显著。

活血开窍汤；大脑中动脉梗死；血脑屏障；Claudin-5蛋白

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.11.11

“活血开窍汤”是由导师李平教授总结出的治疗脑梗死有效的方剂，经多年临床实践证明，此方具有活血开窍、通络补肾的作用，在治疗脑梗死方面具有肯定的疗效。本课题组早期的实验［1-2］已证实，活血开窍汤对大脑中动脉缺血再灌注损伤模型大鼠有一定的脑保护作用，可有效改善模型大鼠的神经功能。而本实验在上述研究的基础上通过观察活血开窍汤不同给药时间对大脑中动脉缺血模型（MCAO）大鼠血脑屏障（BBB）通透性以及脑组织Claudin-5蛋白含量的影响，来探讨活血开窍汤对MCAO大鼠血脑屏障的保护作用机制，以期为临床用药提供实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物清洁级健康雄性Wistar大鼠，体质量200～230 g，由天津医科大学动物中心提供。分笼饲养，饲养温度22～25℃，给予普通饲料（天津医科大学动物中心提供），自由饮水，相对湿度40%～60%。

1.2实验试剂及仪器伊文思蓝（EB）染料（北京化学试剂公司），Claudin-5上下游引物（上海生物工程），4%多聚甲醛、肝素液、注射用青霉素钠、甲酰胺溶液（天津爱基生公司），造模所需手术器械（上海金钟医疗器械厂），直径0.26 mm鱼线（日本PATU公司），恒温冰冻切片机、SDC-6低温恒温槽（Leica公司），低温离心机、超声波粉碎机、移液枪（Eppendorf公司），BECKMAN超高速离心机（美国贝克曼仪器公司），Motic AE31荧光显微镜（Motic公司）。

1.3MCAO模型的制备及分组将大鼠饲养3 d后禁食24 h，采用Zea-Longa线栓法［3］制备大鼠左侧MCAO模型：10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射，待大鼠麻醉后，将其腹面向上固定于手术台上，颈部备皮，于颈部正中稍左0.5 cm作一切口，切开皮肤及皮下组织，依次暴露并分离大鼠左侧颈总、颈内及颈外动脉，结扎颈总及颈外动脉，距颈总动脉分叉处约5 mm处用眼科剪小心剪开一斜行切口，将头端圆钝并经多聚赖氧酸处理的线栓由切口处插入颈内动脉，从血管分叉口开始计算，当插入深度约18 mm时，感到手下有轻微阻力后，放慢速度，以防刺破大脑中动脉。当线栓插入正常长度后（穿到大脑中动脉），结扎颈内动脉，固定线栓后缝合。

排除造模失败及死亡大鼠后，剩余48只造模成功大鼠。按照随机数字表法将模型大鼠随机分为模型组（Model）、活血开窍汤Ⅰ组（造模后2 h给药）、Ⅱ组（造模后24 h给药）、Ⅲ组（造模后48 h给药），每组大鼠均12只。另选取12只大鼠作为假手术组（Sham），Sham组大鼠仅分离颈总、颈内及颈外动脉，不予以结扎及插线。

1.4实验用药及干预方案活血开窍汤煎剂组成：天麻7.5 g，牛膝15 g，远志10 g，葛根15 g，川芎10 g，丹参15 g，苏合香0.5 g，郁金7.5 g，白僵蚕7.5 g，所煎汤剂浓缩至生药成分2 g/mL，所用中药均由天津市南开医院中药房提供，由南开医院药研室煎制浓缩而成。根据人鼠给药剂量换算公式（d大鼠=d人× 0.71/0.11）［4］给予模型大鼠的活血开窍汤生药量为0.21 g/（60 g·d）。活血开窍汤Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组分别在造模后2、24、48 h首次给药，各治疗组均连续灌药7 d，假手术组及模型组分别在造模后24 h每天给予等量的生理盐水连续灌胃7 d。

1.5观察指标及操作

1.5.1大鼠神经功能缺损评分根据Zea-Longa神经功能损伤评价标准［3］（0分:无神经缺损症状。1分：不能伸展对侧前爪。2分：行走时向偏瘫侧转圈。3分：向偏瘫侧倾倒。4分：不能自发行走，意识丧失动）对各组大鼠神经功能缺损情况分别于术后2 h、24 h、72 h、处死前2 h进行评分。

1.5.2缺血侧纹状体伊文思蓝（EB）测定各组大鼠干预7 d后于尾静脉注射2%EB溶液（3 mL/kg），2 h后用生理盐水行心脏灌注以清除血管内的EB，断头取脑，放入液氮中迅速冰冻后移入-80℃冰箱中保存，将冰冻的脑组织在低温恒温槽中切成16～20 μm厚的切片，放入荧光显微镜对缺血侧纹状体组织进行EB含量的测定。

1.5.3大脑皮质Claudin-5阳性细胞表达的测定免疫组化法检测大脑皮质Claudin-5的表达：1）把切片置于37℃烘箱内烘2 h，用0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS）液漂洗5 min×3次。2）0.3%去离子水浸泡10 min，以阻断内源性过氧化酶，0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次。3）山羊血清37℃封闭1 h，甩干，勿洗。4）加入以1∶200比例稀释的山羊抗大鼠Claudin-5多克隆抗体4℃孵育过夜，0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次。5）加入二抗37℃孵育1 h，取出，用0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次。6）加入辣根素37℃孵育15 min，取出，0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次。7）二氨基联苯胺（DAB）显色：加入0.01%DAB显色液显色（3 min，显微镜下掌握染色程度），自来水冲洗。8）苏木素浸泡30 s复染、自来水冲洗。9）1%稀盐酸分化10s-1%氨水返蓝10 s-乙醇梯度脱水85%-90%-95%-100%，各1 min。10）二甲苯透明3 min×2次，用中性树胶封片（阴性对照片以PBS缓冲液代替一抗，其余操作同前）。

1.6统计学处理利用SPSS18.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠神经功能缺损比较大鼠约在造模后1～2 h内苏醒，Sham组无神经功能缺损表现，模型组及各实验组大鼠均出现神经功能缺损症状。各实验组大鼠与模型组比较，神经功能缺损评分差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1　各组大鼠不同时间点神经功能缺损评分（±s）Tab.1　Neural function defect scale at different time points of each group of rats（±s）分

注：与Sham组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。

组别造模后2 h造模后24 h造模后48 h造模后7 d Sham组0000模型组5.66±0.72*5.57±0.58*5.47±0.54*5.34±0.68*活血开窍汤Ⅰ组5.54±0.45*4.76±0.38*#4.38±0.65*#2.35±0.78*#活血开窍汤Ⅱ组5.84±0.54*5.68±0.27*4.91±0.39*#3.74±0.64*#活血开窍汤Ⅲ组5.71±0.62*5.68±0.43*5.36±0.75*4.72±0.81*#

2.2各组大鼠缺血侧纹状体EB含量比较各组大鼠缺血侧纹状体EB信号较对侧明显增强，而Sham组大鼠脑组织中未观测到明显的EB渗漏。模型组、活血开窍汤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组双侧大脑EB含量差异均有统计学意义（P＜0.05）。而各实验组大鼠缺血侧纹状体EB含量明显低于模型组，且差异均有统计学（P＜0.05），并且，活血开窍汤Ⅱ组和Ⅲ组大鼠脑组织中EB浓度较Ⅰ组降低的更为明显，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.3各组大鼠大脑皮质Claudin-5阳性细胞表达的比较Claudin-5在各组大鼠脑组织中呈阳性表达，且染色呈棕黄色，在Sham组大鼠脑血管内皮细胞上表达丰富。与假手术组相比，MCAO模型组和活血开窍汤组阳性细胞表达量减少，造模后2 h首次给药组Claudin-5的表达水平显著降低，呈间断表达。活血开窍汤Ⅱ组和Ⅲ组Claudin-5表达水平较模型组增加，不仅表达于微血管内皮细胞，在微血管周围的星形胶质细胞亦可见其阳性表达。与模型组比较，活血开窍汤Ⅱ组、Ⅲ组脑组织中Claudin-5表达水平增高，各时间点差异具有统计学意义（P＜0.05），见图1、表3。

表2　各组大鼠两侧大脑纹状体中EB含量比较（±s）Tab.2　Comparison of EB content in both sides of the brain striatum in each group of rats（±s）μg/g

注：与模型组相比，*P＜0.05；与Sham组相比，#P＜0.05；与活血开窍汤I组相比，△P＜0.05。

组别缺血侧非缺血侧Sham组3.24±1.06*4.16±0.97模型组17.03±3.09#4.22±0.51活血开窍汤Ⅰ组15.01±2.37#4.24±1.06活血开窍汤Ⅱ组9.86±2.83*#△4.13±0.86活血开窍汤Ⅲ组7.91±2.46*#△4.07±1.03

表3　各组大鼠大脑皮质Claudin-5阳性细胞计数及免疫组化评分（±s）Tab.3　Claudin-5 positive cells expression in cerebral cortex and immunohistochemical score in each group of rats（±s）

注：与模型组相比，*P＜0.05；与Sham组相比，#P＜0.05。

组别阳性细胞比（%）整合光密度值Sham组26.00±5.36*62.56±25.5*模型组19.25±4.09#30.25±15.5#活血开窍汤Ⅰ组21.75±3.37#42.01±15.6#活血开窍汤Ⅱ组22.50±3.83*#44.67±7.11*#活血开窍汤Ⅲ组23.37±3.46*#46.87±7.03*#

3　讨论

脑梗死是指由各种原因引起的脑血流供应障碍，进而造成相应缺血区神经细胞发生不可逆性损伤，出现相应神经功能缺损症状的疾病，属中医学“中风”、“偏枯”等范畴，也是目前导致人类死亡的第2大病因［5］。该病具有较高的复发率和致残率，对患者本人及家属造成了严重的精神和经济负担。中国每年新发生脑卒中患者数在200万以上，每年死于脑卒中的人数超过150万；发生卒中后存活下来的患者多达600～700万，其中四分之三留有不同程度的后遗症［6］。

图1　各组大鼠大脑皮质Claudin-5阳性细胞表达情况Fig.1 Claudin-5 positive cells expression in cerebral cortex in each group of rats

历代医家对中风病因病机的认识虽各有偏颇，不同流派见仁见智，但无论是风、火、痰、瘀、虚何种病因所致，其病理变化的最终结局都是脉络不通、血脉不畅。可以认为血瘀是中风病的根本原因，而“瘀阻脑络”则是缺血性中风的病理本质。由此可见，“血瘀闭阻，脑窍不通”是中风病的本质病机。因此开窍启闭，祛除瘀、痰、风等邪气则为治疗中风病的根本大法，活血开窍汤即是基于上述对中风病的基本认识而进行组方用药的，并为大量临床实践证明疗效显著。方中川芎、丹参、牛膝活血祛瘀；郁金祛痰开郁，并有加强活血化瘀的功效；苏合香开窍辟秽；远志祛痰开窍，辅以白僵蚕共奏开窍辟秽祛痰之功；天麻、白僵蚕合用以熄风平肝；葛根升阳生津以利脑。诸药合用，共奏开窍活血祛痰之效。

BBB是一个扩散屏障，由脑的微血管系统和周细胞组成，BBB只允许水和脂溶性小分子自由扩散，对维持中枢神经系统内环境的稳态起着重要的作用［7］。在脑缺血后，血脑屏障受到一定的破坏，其对小分子物质EB的通透性会增加，所以EB渗透率变化是衡量BBB通透性的一个客观的指标［8］。而血管内皮细胞之间的紧密连接则是形成BBB的关键因素［9］，紧密连接使大脑形成了一个扩散屏障，维持了中枢神经系统的稳态。其中，跨膜蛋白Claudin对BBB的紧密连接起着重要作用。Claudin和相邻内皮细胞的Claudin相互独特地连接在一起，进而形成了紧密连接的初级封口［10］。当Claudin蛋白出现结构和功能上的障碍时，血脑屏障功能都会随之改变。而Claudins家族成员，尤其是Claudin-5是决定细胞旁通透性的一个重要因素［11］。所以，本实验通过观察MCAO大鼠缺血脑组织Claudin-5蛋白含量及EB渗透率的变化来反应通窍活血汤对大鼠BBB通透性的影响是可行的。

本实验结果显示，所有实验组大鼠缺血区大脑纹状体中EB含量均低于MCAO模型对照组，表明实验组各组MCAO模型大鼠BBB的通透性低于模型对照组，由此可推断，活血开窍汤发挥其神经保护作用的机制与降低大鼠BBB的通透性，最终维持BBB的完整性相关。并且，相关的多项研究［12-14］已证实，活血类药物对BBB确有一定的保护作用，本研究结果与以上研究结果基本一致。其中，活血开窍汤Ⅱ组和Ⅲ组模型大鼠缺脑血区纹状体中EB浓度较Ⅰ组降低的更为明显（P＜0.05），表明急性期使用活血开窍汤对降低BBB的通透性作用并不十分明显，而在恢复期应用活血开窍汤对大鼠BBB的通透性改善地更为显著。同时，MCAO模型大鼠缺血侧脑组织Claudin-5蛋白表达明显减少，活血开窍汤组相同区域阳性细胞的表达虽较假手术组偏少，但与MCAO模型对照组相比，Claudin-5阳性细胞的表达量显著增高（P＜0.05）。并且在活血开窍汤3个亚组中，以Ⅱ组Claudin-5阳性细胞表达最多，亦说明活血开窍汤在非急性期使用比在急性期使用对BBB的保护作用更为明显。

4　结论

活血开窍汤可通过减轻BBB的通透性，降低缺血区大脑纹状体中的EB含量，减少Claudin-5蛋白的破坏从而保护MCAO大鼠血脑屏障，但在急性期应用活血开窍汤对BBB的保护作用并不明显，且尚不能证明在非急性期越早给予活血开窍汤对大鼠BBB的保护作用就越显著。脑梗死是一个多环节、多途径的复杂的病理过程，通过研究活血开窍汤对BBB的影响来验证其对MCAO模型大鼠脑保护作用，为活血开窍汤神经保护作用机制的研究奠定了一定的基础。而活血开窍汤是否适合在脑缺血急性期使用，以及何时给药效果最佳等问题还有待于后续深入的研究。

［1］张丽丽.活血开窍汤对大鼠脑缺血再灌注损伤NO含量及细胞凋亡的影响［D］.天津:天津医科大学，2013.

［2］李明花.活血开窍汤对脑缺血再灌注损伤大鼠SOD、MDA的影响［D］.天津:天津医科大学，2013.

［3］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occludion without crainectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）:8-87，84-91.

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［5］常富业，李云，陈燕，等.中风病二级预防中医药参与状况的研究［J］.天津中医药，2010，29（2）:99-100

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［7］Bernacki J，Dobrowolska A，Nierwiñska K，et al.Physiology and pharmacological role of the blood-brain barrier［J］.Pharmacological Reports，2008，60（5）:600-622.

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［13］何锐，王慕真，邓婉青，等.活血化瘀药抗大鼠脑缺血-再灌注性血脑屏障损伤的保护作用［J］.中国医院药学杂志，2003，23（10）: 579-582.

［14］何平平.脑缺血再灌注损伤对羟基红花黄色素A透过血脑屏障的研究［D］.济南：山东大学，2009.

（本文编辑：马英，滕晓东）

Effects of“Huoxue Kaiqiao”decoction on the behavior and blood-brain barrier in middle cerebral artery occlusion rats

ZHAO Jin-sheng1，2，MENG Fan-zheng1，YIN Yun2，LI Ping3
（1.Department of Neurology，Tianjin Nankai Hospital，Tianjin 300100，China；2.Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；3.Tianjin Third Central Hospital，Tianjin 300170，China）

［Objective］To investigate the time-effect relationship of“Huoxue Kaiqiao”decoction on the behavior and blood-brain barrier（BBB）in middle cerebral artery occlusion rats.［Methods］The 48 MCAO Wistar model rats were randomly divided into model group and“Huoxue Kaiqiao”decoction groups（group I:administration 2 hours after modeling；group II:administration 24 hours after modeling and group III:administration 48 hours after modeling）.Each group contained 12 rats，and another 12 rats made up sham operation group.Zealonga scoring method was used to observe the neurological deficit situation of rats.Two hours before death from intravenous injection of EB solution in order to observe changes in BBB permeability，and another taking fixed brain to detect Claudin-5 protein content by immunohistochemistry method.［Results］Compared with the control group，nerve function were improved in all treatment groups（P＜0.05）. Cerebral ischemic striatum EB in treatment groupⅡandⅢwere lower than the model group（P＜0.05），but the content of Claudin-5 in these groups were high（P＜0.05）.However，the difference was not statistically significant between groupⅡand groupⅢ，and between group I and model group（P＞0.05）.［Conclusion］Resuscitation promoting blood circulation by reducing BBB permeability soup can reduce damage Claudin-5 protein in rat brain barrier to protect MCAO，but the protective effect in the acute phase of the BBB is not obvious，and yet could not prove that in the non-acute phase sooner promoting blood circulation giving resuscitation BBB decoction of the more remarkable.

“Huoxue Kaiqiao”decoction；MCAO；blood-brain barrier；Claudin-5 protein

R743.32

1672-1519（2015）11-0679-05

天津市科技攻关项目（05YFSZSF02600）。

赵金生（1986-），男，博士研究生，住院医师，主要从事中西医结合脑血管病的防治和循证医学研究工作。

李平，E-mail：lipingtjutcm@sina.com。

（2015-05-29）