王　丹，赵　浩，薛　鸾，刘　霁

补肾药与祛风药配伍控制狼疮小鼠狼疮肾炎进展的实验研究*

王丹1，赵浩2，薛鸾1，刘霁1

（1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院风湿科，上海200437；2.上海长宁区光华中西医结合医院急诊类风关科，上海200092）

［目的］观察补肾中药与祛风中药配伍对狼疮小鼠病情活动的影响。［方法］50只MRL/lpr狼疮小鼠随机分为5组，补肾组、祛风组、补肾祛风组、西药组、生理盐水组，同时设置10只BAbl/c小鼠对照。分别给予对应的中西药物治疗6周，观察小鼠体质量、尿蛋白、尿红细胞、尿白细胞及双链（天然）脱氧核糖核酸（ds-DNA）、白介素-17（IL-17）变化。［结果］各组小鼠随着周龄增长体质量均有增加，其中祛风组增加较少，与其他各组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。各给药组ds-DNA水平低于生理盐水组（P＜0.05）。补肾祛风组ds-DNA下降明显，优于其他各给药组（P＜0.05）。与生理盐水组比较，其他各给药组IL-17下降明显（P＜0.05），且补肾祛风组优于西药组，西药组优于补肾组及祛风组（P＜0.05）。尿常规情况，生理盐水组7只小鼠出现红细胞，其他各组与生理盐水组比只数较少，但各组与生理盐水组比较差异均无统计学意义（P＞0.003 12）。生理盐水组所有小鼠均出现尿蛋白阳性，与其他各组比差异有统计学意义（P＜0.003 12）；除生理盐水组，其他各给药组之间差异无统计学意义（P＞0.003 12）。［结论］补肾药与祛风药配伍能明显降低狼疮小鼠IL-17和ds-DNA表达，起到控制狼疮肾炎的作用，效果优于单独使用补肾药和祛风药。

补肾药；祛风药；狼疮小鼠；狼疮肾炎

近几年系统性红斑狼疮（SLE）的治疗已发展到靶向治疗，但糖皮质激素依然是不可替代的治疗药物，有关此方面的研究不仅涉及效益与风险评估，同时如何减轻糖皮质激素的不良反应，也被临床医生所重视。在糖皮质激素应用的同时，防治骨质疏松药物、保护胃黏膜药物被广泛使用。而中药在SLE中的应用有着多年的历史，可以增强临床疗效，并起到减少感染、减轻激素引起的兴奋、失眠、胃溃疡等不良反应。笔者在临床实践中采用补肾药和祛风药配伍，能使患者蛋白尿得到较快的控制，为进一步观察药物配伍的作用及其可能起效机制，采用MRL/lpr狼疮小鼠为模型，给予中药治疗，对小鼠的肾炎情况及白介素-17（IL-17）水平进行了观察，现报道如下。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1动物8周龄SPF级雌性MRL/lpr狼疮小鼠，由中科院上海斯莱克实验动物中心引种培育。SPF级Babl/c小鼠购自中科院上海斯莱克实验动物。饲养于中科院上海实验动物中心SPF级隔离饲养间。

1.1.2药物组成补肾药采用六味地黄丸，按组方由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院制剂室制成每毫升含生药1.5 g的水煎剂。祛风药采用蝉蜕、防风、白蒺藜等，由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院制剂室制成每毫升含生药1.5 g的水煎剂。补肾药与祛风药的合剂按上述工艺制备。西药采用甲强龙，由辉瑞制药有限公司生产，上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院西药房提供。

1.2方法

1.2.1动物分组与给药采用Excel生成随机数字，将50只MRL/lpr狼疮小鼠随机分为5组，补肾组、祛风组、补肾祛风组、西药组、生理盐水组，同时设置10只Babl/c小鼠为对照组。确定临床患者每日所需剂量，根据徐淑云主编的《药理学实验方法》，按公式：小鼠剂量（g/kg）=人用剂量×0.0026×50 g计算，由于补肾药和祛风药所采用的剂量不同，所以最终给药总毫升数不同，补肾组给药0.3mL，祛风组给药0.2mL，补肾祛风组给药0.5mL，西药组给药0.5mL，生理盐水组0.5mL，Babl/c小鼠给予生理盐水0.5mL。共给药6周。

1.2.3观察指标每2周测1次小鼠体质量，并检测尿常规1次，样本送上海天祥医学检验所检测，仪器：桂林优利特Uritest500B尿常规检测仪，试剂：优利特G系列尿试纸，试纸批号：G1112013。给药6周后，眼球取血处死小鼠，酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清双链（天逸）脱氧核糖核酸（ds-DNA）、IL-17。IL-17试剂盒批号1212304，ds-DNA试剂盒批号1212305，均为RND分装试剂盒。

1.3统计学处理所有数据采用SPSS18.0统计学软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间计量资料的比较采用单因素方差分析，组间两两比较检验采用LSD法，重复测量设计的比较采用重复测量的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。组间率的分析采用Fisher精确法，检验水准为0.003 12。

2　结果

2.1各组小鼠体质量变化情况各组小鼠随着周龄增长体质量均有增加，第42天和入组时比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中祛风组增加较少，与其他各组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1　各组小鼠体质量变化情况（±s）Tab.1　Changes in bodyw eight ofm ice in each group（±s）g

表1　各组小鼠体质量变化情况（±s）Tab.1　Changes in bodyw eight ofm ice in each group（±s）g

注：与组内第1天比较，*P＜0.01；与生理盐水组比较，#P＜0.05；与对照组比较，△P＜0.05。

组别　　第1天　　第14天　　第28天　　第42天补肾组　23.12±1.35　25.33±1.69　27.87±1.17　27.66±1.82*△祛风组　22.91±2.03　23.22±1.79　24.78±2.14　25.15±1.88*#△补肾祛风组　23.01±1.76　27.32±2.81　27.48±2.23　28.45±2.75*西药组　22.36±2.15　24.72±2.09　26.67±1.94　27.01±1.58*△生理盐水组　22.15±2.17　25.77±2.08　26.58±1.94　28.75±2.09*对照组　23.77±1.84　26.88±1.76　28.29±2.01　30.46±2.15*

2.2各组小鼠ds-DNA及IL-17表达情况各给药组ds-DNA水平低于生理盐水组；补肾祛风组ds-DNA下降明显，优于其他各给药组（P＜0.05）；补肾组和西药组的ds-DNA表达未见明显差异，但西药组有下降明显的趋势；与生理盐水组比较，其他各给药组IL-17下降明显（P＜0.05），且补肾祛风组优于西药组，西药组优于祛风组及补肾组（P＜0.05）。见表2。

表2　小鼠ds-DNA及IL-17表达情况（±s）Tab.2　Expression of ds-DNA and IL-17 ofm ice in each group（±s）pg/m L

表2　小鼠ds-DNA及IL-17表达情况（±s）Tab.2　Expression of ds-DNA and IL-17 ofm ice in each group（±s）pg/m L

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05；与补肾祛风组比较，#P＜0.05；与西药组比较，△P＜0.05。

组别　ds-DNA　IL-17补肾组　25.20±2.78*#　54.98±3.67*#△祛风组　26.32±2.68*#　52.38±4.82*#补肾祛风组　20.93±1.95*　45.66±4.29*西药组　23.49±2.93*#　50.69±2.58*#生理盐水组　29.90±2.31#　70.83±4.91#对照组　10.98±1.03　38.52±2.47

2.3尿常规测定情况检测尿常规，观察各组出现红细胞、白细胞、或蛋白尿小鼠的数目。狼疮小鼠随着病程进展，生理盐水组7只小鼠出现红细胞，红细胞发生率为70%，其他各组红细胞发生率较低，但所有组与生理盐水组比较均无统计学意义（P= 0.01＞0.003 12）；生理盐水组所有小鼠均出现尿蛋白阳性，与其他各组比较有统计学差异（P=0.003＜0.003 12）。除生理盐水组，其他各给药组之间未见统计学差异（P＞0.05）。各组白细胞比较无统计学差异。见表3。

3　讨论

SLE作为比较棘手的自身免疫性疾病，临床起病隐匿，变化迅速。尽管目前已有多种药物和多种手段应用于SLE的治疗，但由于疾病在稳定的情况下会突然发生变化，并且激素和免疫抑制剂的应用使得SLE的死亡原因发生了改变，因此如何减轻药物不良反应和降低疾病复发几率，依然是风湿界不断探索的问题。

中药治疗SLE有多年的历史，治疗原则大体可分为补益脾肾和清热解毒［1-4］。笔者采用补肾祛风的治疗方法，源于王庆其教授“顽病治风”的理念［5-7］，因“风为百病之长，善行而数变”，这与SLE临床变化多端的特点不谋而合。而补肾法在SLE中亦有广泛应用，包括补肾阴、补肾阳以及阴阳双补。中医认为“肾生髓、髓生血”，骨髓的造血干细胞是各种免疫细胞的来源。从现代药理学角度，祛风药被认为有抗变态反应作用［8-9］，而多数补肾中药，能调节垂体-肾上腺轴，改变免疫状态［10-12］。

对MRL/lpr狼疮小鼠给予不同中药治疗，结果显示各组小鼠体质量均有增加，仅祛风组小鼠的体质量增加稍低于其他各组，祛风药有利水消肿的作用，实验中的小鼠并未观察到明显水肿或腹水，但并不排除有内脏水肿的存在，但补肾祛风组小鼠的体质量高于祛风组，因此祛风组体质量偏轻的原因尚不能解释。给药过程中，西药组在第13周有1只小鼠死亡，对死亡小鼠进行解剖发现肾脏及脾脏均存在明显的肿胀，肺部有感染，可能是由于糖皮质激素应用并发感染，也可能因灌药不慎引起。从理论上讲，MRL/lpr小鼠在6月龄左右开始出现死亡［13］，本研究采用8周龄小鼠进行研究，小鼠处于发病初期，病情较轻，由疾病本身导致死亡的可能性不大。

表3　各组小鼠尿常规情况Tab.3　Urine convention ofm ice in each group

临床上狼疮肾炎可表现为慢性肾小球肾炎、肾病综合征等，补肾药可明显减轻顽固性蛋白尿［14］，本研究发现各给药组均有改善狼疮肾炎的作用，有降低ds-DNA、减少蛋白尿的作用，其中补肾祛风组效果相对明显。这与祛风中药有抗变态反应的作用可能有关，提示在补肾药基础上加予祛风药有助于缓解狼疮肾炎。笔者将在后续的实验中进一步对肾脏进行病理学检测。

IL-17是由Th17分泌的促炎性细胞因子，在调节免疫和炎症应答中发挥重要作用，已有研究证实，IL-17在多种自身免疫性疾病中表达增高，处于活动期的SLE患者IL-17水平明显高于稳定期患者［15-16］。NZB/W F1狼疮小鼠是国际公认的研究SLE的经典动物模型，已经证实［17-19］NZB/W F1狼疮小鼠在发病过程中产生的自身抗体，以及肾脏病理损害均与人类SLE非常相似，存在IL-6、IL-17等多种细胞因子的异常表达。本实验发现在MRL/lpr狼疮小鼠中IL-17的表达水平明显高于Babl//c小鼠，经药物治疗后各组均有下降，其中补肾祛风组较为明显，这与观察小鼠蛋白尿缓解情况一致，提示IL-17可能是药物起效的途径之一。

［1］徐俊良.系统性红斑狼疮中医辨治旨要［J］.江苏中医药，2007，39（6）：56-57.

［2］惠乃玲，李振彬，杨静.从“毒”论治系统性红斑狼疮［J］.河北中医，2008，30（12）：1276-1278.

［3］李莉，田甜，应森林.从“毒”论治系统性红斑狼疮［J］.天津中医药大学学报，2012，31（4）：205-207.

［4］高景环，孟祥震.狼疮肾炎临床诊治体会［J］.天津中医药，2007，24（4）：293.

［5］王庆其.杏林散叶［M］.北京：人民卫生出版社，2011：16.

［6］王庆其.顽病不妨治风［J］.中国医药学报，1997，12（1）：45-48.

［7］王庆其.王庆其内经讲稿［M］.北京:人民卫生出版社，2010：293-295.

［8］刘金霞.御风敏鼻片治疗变态反应性鼻炎98例［J］.陕西中医，2007，28（9）：1193-1194.

［9］扬淳，田维毅.防风多糖对巨噬细胞分泌细胞因子的影响［J］.贵阳中医学院学报，2011，33（4）：31-33.

［10］李发胜，徐恒瑰，李明阳，等.熟地多糖提取物对小鼠免疫活性影响［J］.中国公共卫生，2008，24（9）：1109-1100.

［11］王学廷，成莉霞，王建刚，等.山萸肉对小鼠免疫功能的影响［J］.河南医药信息，1998，6（6）:30-31.

［12］李崭，刘仁慧，康学，等.择时合用滋阴、益阳方对肾虚衰老模型HPAT轴的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（24）: 256-259.

［13］Peden-AdamsMM1，Eudaly JG，Lee AM，etal.Lifetimeexposure to trichloroethylene（TCE）does notaccelerate autoimmune disease in MRL+/+mice［J］.JEnviron SciHealth A Tox Hazard SubstEnviron Eng，2008，43（12）:1402-1409.

［14］袁红霞，林嫦娥.黄文政教授治疗顽固性蛋白尿经验总结［J］.天津中医药，2003，20（5）：18-19.

［15］Dolff S，Bijl M，Huitema MG，et al.Disturbed Th1，Th2，Th17 and T（reg）balance in patientswith systemic lupus erythematosus［J］.Clin Immunol，2011，141（2）:197-204.

［16］Shah K，Lee WW，Lee SH，et al.Dysregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Res Ther，2010，12（2）:R53.

［17］Edgerton C，Crispin JC，Moratz CM，etal.IL-17 producing CD4+T cells mediate accelerated is chemiarepefusion-induced injury in autoimmunity-pronemice［J］.Clin Immunol，2009，130（3）:313-321.

［18］Chang NH，Cheung YH，Loh C，et al.B Cell Activating factor（BAFF）and T cells cooperate to breach B cell tolerance in lupus-prone new zealand black（NZB）mice［J］.Plos one，2010，5（7）: e11691.

［19］Tang X，Zhang B，Jarrell JA，et al.Ly108 expression distinguishes subsets of invariant NKT cells that help autoantibody production and secrete IL-21 from those that secrete IL-17 in lupus prone NZB/Wmice［J］.JAutoimmun，2014，50:87-98.

（本文编辑：马英，高杉）

Experimentalstudy on compatibility of invigorating kidney herbsand dispellingwind herbsused in lupusm ice to control the progressof lupusneph ritis

WANGDan1，ZHAOHao2，XUELuan1，LIUJi1

（1.Departmentof Rheumatology，Yueyang Hospitalof Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，ShanghaiUniversity of TraditionalChineseMedicine，Shanghai200437，China；2.DepartmentofArthritis Emergency，Guanghua IntegrativeMedicine Hospital in Changning District，Shanghai200092，China）

［Objective］Toobserve the effectsof compatibility of invigorating kidney herbsand dispellingwind herbs used in lupusmice.［M ethods］Fifty lupusmice were random ly divided into five groups，and they were invigorating kidney group，dispelling wind group，invigorating kidney and dispellingwind group，medicine group and normal saline group.Another10 BAbl/cmicewere used to compare. Each group wasgiven the corresponding herbsandmedicine for sixweeks.［Results］Theweightof themice in each group increased with weeks growth，the dispelling wind group increased lower significantly than other groups（P＜0.05）.The level of ds-DNA in groups that given herbs andmedicinewas lower than in normal saline group（P＜0.05）.The level of ds-DNA in invigorating kidney and dispelling wind group declined significantly than other groups（P＜0.05）.The level of IL-17 in groups that given herbs and medicine declined significantly than normal saline group（P＜0.05），and the invigorating kidney and dispellingwind group was lower thanmedicine group which was lower than invigorating kidney group，dispelling wind group，but no difference among each group.There were sevenmice of normalsalinegroup occurred erythrocytes in urinewhichwasmore than othergroups，butno differenceamong each group（P＞0.003 12）. All them ice ofnormal saline group appeared urinary protein which weremore than other groups（P＜0.003 12）and therewasno difference between the groupsexceptnormal saline group（P＞0.003 12）.［Conclusion］Compatibility of invigorating kidney herbs and dispelling wind herbs can control the development of lupus nephritis through the way of declining the expression of IL-17 and ds-DNA in Lupus Micesignificantly，which effectswerebetter than using invigoratingkidney herbsor dispellingwind herbsalone.

invigorating kidney herb；dispellingwind herb；lupusmice；lupusnephritis

R593.24

A

1672-1519（2015）02-0098-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.02.09

上海市教委资助项目（2011JW46）。

王丹（1980-），女，硕士，主治医师，主要从事中西医结合治疗风湿病的临床和基础研究。

（2014-09-27）