常江，王颖，柳利，王满仓Δ

IGF2BP3低甲基化与结肠癌组织分化的关系

常江1，王颖2，柳利1，王满仓1Δ

目的 探讨IGF2BP3低甲基化与结肠癌组织分化之间的关系。方法 收集2011年3月—8月在我院就诊的结肠癌组织标本41例，其中高分化腺癌19例，中分化腺癌12例，低分化腺癌10例，同时收集结肠炎标本12例作为对照。免疫组化和Western blot检测标本IGF2BP3表达。改进ELISA法检测标本DNA总甲基化水平，甲基化特异性PCR（MS-PCR）检测IGF2BP3甲基化水平。结果 免疫组化和Western blot结果示结肠癌组织IGF2BP3表达高于结肠炎组织（P＜0.05），低分化结肠癌组IGF2BP3表达水平最高，中、高分化程度间表达无明显差异。结肠癌组基因总甲基化水平和IGF2BP3甲基化水低于结肠炎组（均P＜0.05），且随着结肠组织分化程度降低，IGF2BP3甲基化水平依次降低（P＜0.05）。结论 IGF2BP3甲基化水平与结肠癌分化程度密切相关，在调控结肠癌组织IGF2BP3表达中具有重要价值。

胰岛素样生长因子2信使RNA结合蛋白3；结肠癌；DNA甲基化；分化；免疫组织化学；甲基化特异性PCR

胚胎发育过程中胰岛素样生长因子2信使RNA结合蛋白3（IGF2BP3）在RNA转位、固定、细胞生长及细胞迁移中扮演重要角色［1］。研究发现IGF2BP3在胰腺癌、肺癌、食管癌、甲状腺癌等多种恶性肿瘤组织中表达［2］。有研究证实IGF2BP3与结肠癌等肿瘤的预后相关，但IGF2BP3在结肠癌分化中的作用及机制尚不清楚［3］。目前通过表观遗传学尤其是DNA甲基化探索结肠癌发病机制已成为研究热点［4］。鉴于此，本研究拟通过观察IGF2BP3甲基化在不同分化结肠组织中的表达，探讨IGF2BP3甲基化与结肠癌分化程度的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2011年3月—8月内蒙古巴彦淖尔市医院普外一科手术切除的结肠癌组织标本41例，所有标本均经病理形态学检查证实，临床病理资料完整。年龄：≤60岁19例，＞60岁22例。性别：男25例，女16例。肿瘤最大径：＞5 cm 13例，≤5 cm 28例。分化程度：低分化10例，中分化12例，高分化19例。肠壁浸润程度：T1+T2 6例，T3+T4 35例。淋巴结转移：无转移19例，有转移22例。远处转移：无转移32例，有转移9例。TNM分期：Ⅰ期+Ⅱ期17例，Ⅲ期+Ⅳ期24例。收集同期12例结肠镜活检结肠炎标本作为对照。

1.2 主要试剂 IGF2BP3鼠抗人单克隆抗体、羊抗鼠二抗及DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），DNA提取试剂盒与PCR试剂（Promega生物技术有限公司），基因组总甲基化检测试剂盒（美国Epigentek公司），DNA甲基化修饰试剂盒（美国ZYMO公司），BCA蛋白定量试剂盒（凯基生物科技发展有限公司）。

1.3 免疫组化 4%甲醛溶液固定标本，常规石蜡包埋后，4 μm连续切片，然后进行HE染色和免疫组化染色。免疫组化采用SP法，使用枸橼酸钠缓冲液进行高压修复5 min，3% H2O2通透10 min，10%山羊血清封闭30 min，滴加IGF2DP3一抗4℃过夜，二抗37℃孵育1 h，DAB显色后苏木精复染，中性树胶封片，镜下观察并采集图像。IGF2BP3的阳性表达指数用染色强度分数×染色细胞比例分数表示。染色强度按颜色评分:完全阴性0分，淡黄色1分，黄色2分，棕黄色3分。阳性细胞染色百分比＜5%、5%～24%、25%～49%、50%～74%、≥75%分别计0、1、2、3、4分。同时采用Image-Pro Plus 5.0对IGF2BP3阳性细胞的平均光密度值进行定量分析。

1.4 Western Blot检测IGF2BP3蛋白表达 取各组织标本100 mg，加500 μL蛋白裂解液提取标本总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每孔40 μg蛋白行SDS-PAGE，100 V湿转1 h将蛋白转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭1 h，以β-actin为内参，PBS洗膜后加入一抗（1∶200）4℃过夜。次日加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG（1∶3 000），室温孵育1 h，化学发光法显影、曝光，UVI凝胶成像系统成像，Image-Pro Plus 5.0进行灰度值分析，计算蛋白相对表达量。

1.5 DNA总甲基化水平检测 取20 mg组织标本提取DNA，紫外分光光度计测定浓度后取200 ng DNA检测总甲基化水平。操作步骤严格按照说明书执行。实验结束后酶标仪检测各标本在450 nm处的光密度（OD）值，根据如下公式计算基因组甲基化水平，公式中X=41%是指人类基因组中GC的平均含量。Methylation%=［（SampleOD-NegativeControlOD）/X］/［（PositiveControlOD-NegativeControlOD）］×100%。

1.6 基因组DNA亚硫酸盐修饰 取纯化的标本DNA 500 ng用于亚硫酸盐修饰，严格按照操作说明书执行。标本经过结合、脱硫、洗脱等步骤后可获得10 μL亚硫酸氢盐修饰后的基因组DNA，用于后续PCR反应。经修饰后的基因组DNA，非甲基化胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U），在PCR反应中扩增为胸腺嘧啶（T），而5甲基胞嘧啶（5-mC）不变。

1.7 IGF2BP3基因甲基化水平检测 应用甲基化特异性PCR（MS-PCR）进行检测，Meth Primer软件设计IGF2BP3引物序列并委托Invitrogen公司合成。IGF2BP3甲基化引物：上游5′-AAAGGGGATTTAGGTTACGGTCATA-3′，下游5′-CCATAAAAAAAAACAAAAACTAAACG-3′，产物长度165 bp；IGF2BP3非 甲 基 化 引 物 ：上 游 5′-ATATGG TTAGAAAGGGTTTAGGTGA-3′，下游 5′-CCATAAAAACAAAAACTAAAAAAACAC-3′，产物长度为164 bp。PCR反应体系：GoTaq®GreenMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 4 μL，无核酸酶H2O 6.5 μL。反应条件：94℃预变性2 min；94℃30 s，67℃10 s，72℃30 s，35个循环；72℃10 min。凝胶成像系统测量目的片段灰度值，以甲基化条带灰度值/非甲基化条带灰度值计算样本甲基化水平。

1.8 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。非正态分布数据进行数据变换后，采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化 IGF2BP3定位于细胞浆，呈淡黄色、黄色或棕黄色，见图1。与结肠炎（A）组相比，结肠癌组织中IGF2BP3表达升高（均P＜0.05），且低分化（D）组高于高分化腺癌（B）组和中分化（C）组（均P＜0.05），中分化组与高分化组表达差异无统计学意义。光密度值法分析结果与积分法结果一致，见表1。

Tab.1 The IGF2BP3 positive index and integrated optical density（IOD）in colon tissues with various differentiation表1 不同分化结肠组织IGF2BP3阳性表达指数与平均光密度值比较 （±s）

Tab.1 The IGF2BP3 positive index and integrated optical density（IOD）in colon tissues with various differentiation表1 不同分化结肠组织IGF2BP3阳性表达指数与平均光密度值比较 （±s）

＊＊P＜0.01，a与A组比较，b与B组比较，c与C组比较，P＜0.05，图2～4同

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Fig.1 The expression of IGF2BP3 in colon tissues with various differentiations（×200）图1 不同分化结肠组织IGF2BP3表达（×200）

2.2 IGF2BP3蛋白表达水平 与结肠炎组相比，结肠癌组织IGF2BP3蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。低分化结肠癌组IGF2BP3表达高于高分化和中分化组（P＜0.05），中、低分化组间表达无明显差异，见图2。

Fig.2 The expressions of IGF2BP3 protein in colon tissue with various differentiations图2 不同分化结肠组织IGF2BP3蛋白表达水平

2.3 IGF2BP3基因甲基化水平 结肠炎组IGF2BP3甲基化水平高于其他3组（P＜0.05）。结肠癌组织IGF2BP3甲基化水平随组织分化程度的降低依次降低（P＜0.05），见图3。

Fig.3 IGF2BP3 methylation status of colon tissue with various differentiations图3 不同分化结肠组织IGF2BP3甲基化水平

2.4 不同分化结肠组织基因组总甲基化水平 结肠炎组织基因总甲基化水平高于其他3组（P＜0.05），低分化腺癌低于高分化和中分化腺癌（P＜0.05），而高分化与中分化腺癌甲基化水平无明显差异，见图4。

Fig.4 The global methylation status of colon tissue with various differentiation图4 不同分化结肠组织基因组总甲基化水平

3 讨论

结肠癌是临床常见的恶性肿瘤，发病率位列所有肿瘤第3位，2013年，美国9%的肿瘤患者死于结肠癌［5］，我国目前无相关的流行病学数据。因其死亡率较高，为更好判断肿瘤的诊断和预后，特异性生物标志物成为结肠癌研究的重要方向。目前ColoVantage和ColoSure等DNA甲基化标志物已经应用于临床实践，指导结肠癌诊断和预后判断［6］。肿瘤的发生过程伴随原癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化。既往的结肠癌生物标志物大多聚焦于抑癌基因甲基化研究，有关原癌基因甲基化修饰在结肠癌分化中的作用研究较少。IGF2BP3是RNA结合、癌胚蛋白保守家族成员，在细胞增殖、迁移、代谢及分化中具有重要作用。

目前诸多研究支持IGF2BP3作为一种原癌基因参与肿瘤的发生发展［7］。体外培养肺癌和乳腺癌细胞中过表达IGF2BP3可增加细胞侵袭性［8］。在小鼠黑色素瘤模型中，黑色素瘤细胞过表达IGF2BP3可促进肿瘤生长，血管生成及转移［9］。临床研究发现IGF2BP3是结肠癌病理分型和预后判断的重要标志物［10-11］。本研究发现在不同分化程度的结肠癌组织中均有IGF2BP3表达，且在低分化组织中，其表达量较高，与上述研究结果相一致。基因组总甲基化水平降低是细胞增殖水平升高的重要表现。本研究显示结肠癌组织基因总甲基化水平低于结肠炎组织，且低分化组织总甲基化水平低于高分化和中分化组织。有研究采用LINE-1甲基化作为基因组总甲基化水平的指示因子，发现LINE-1低甲基化与结肠癌组织分化和预后相关，且LINE-1低甲基化与IGF2BP3高表达和结肠癌预后不良相关［12］。本研究发现，结肠炎组织IGF2BP3甲基化水平高于其他结肠癌组织，且随着分化程度减低，IGF2BP3甲基化水平逐渐减低，提示IGF2BP3低甲基化是IGFBP3表达升高的主要原因，与结肠组织分化密切相关。高分化和中分化结肠癌组织两组之间无明显差异，可能与样本量相对较少和存在选择偏倚有关。IGF2BP3低甲基化可能成为一种新的判断结肠癌分化和预后的重要生物学标志物，在表观遗传学迅猛发展的大背景下，具有广泛的应用前景。一方面需进一步探索IGF2BP3低甲基化调控其表达的机制；另一方面，需要更多的临床研究去求证IGF2BP3低甲基化用于结肠癌早期诊断、预后评估的科学性和可行性。

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（2014-10-16收稿 2015-01-07修回）

（本文编辑 胡小宁）

The relationship between IGF2BP3 hypomethylation with colon tumor differentiation

CHANG Jiang1，WANG Ying2，LIU Li1，WANG Mancang1Δ
1 Department of General Surgeon，2 Department of Nephrology，Inner Mongolia Bayannaoer City Hospital，Inner Mongolia 015000，China
ΔCorresponding Author E-mail:rh6917@aliyun.com

Objective To investigate the relationship between IGF2BP3 hypomethylation with colon tumor differentiation.Methods Tissue samples from 41 colorectal cancer were collected from March 2011 to August 2011 in our hospital，among which 19 cases were well-differentiated adenocarcinoma，12 cases were of moderately differentiated adenocarcinoma and 10 cases were of poorly differentiated adenocarcinoma.Meanwhile biopsy samples from 12 cases of colonic colitis were collected as a control.The expression of IGF2BP3 was assessed by immunohistochemistry and Western blot.An innovate of ELISA technique was used to examine global methylation levels while IGF2BP3 methylation level was tested by methylation specific PCR technique.Results The expressions of IGFBP3 are higher in all colon cancer groups than that in colitis（P＜0.05）.The expression of IGFBP3 in poorly differentiated adenocarcinoma is higher than that in all the other groups，but there is no significant difference between its expressions in the well differentiated group and in the moderately differentiated adenocarcinoma group.The global DNA level and IGFBP3 methylation level of every colon cancer group is lower than those in colitis（P＜0.05）.Also，a tendency of decreasing global DNA and IGFBP3 methylation status was observed comparing well differentiated towards poorly differentiated carcinomas（P＜0.05）.Conclusion IGF2BP3 expression in colorectal cancer is associated with differentiation of colon cancer tissue.A lower global and IGF2BP3 DNA methylation suggest a worse differentiation of colon cancer.DNA hypomethylation may therefore play a regulatory role in the expression of IGF2BP3 in colon cancer tissue.

IGF2BP3；colonic neoplasms；DNA methylation；differentiation；immunohistochemistry；methylation-specific PCR

R735.3

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.017

1内蒙古自治区巴彦淖尔市医院普外科（邮编015000），2肾内科

常江（1977），研究生，主治医师，主要从事胃肠道肿瘤的防治研究

E-mail:rh6917@aliyun.com