吴楠，闵鹤鸣，屈惠莹，包翠芬△

自噬基因pULK、PI3KC3在非小细胞肺癌中的表达及相关性研究

吴楠1，闵鹤鸣2，屈惠莹1，包翠芬2△

目的 探讨自噬基因pULK、PI3KC3在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及相关性。方法 随机抽取NSCLC患者（肺癌组）77例（鳞癌31例、腺癌31例、大细胞未分化癌15例）及其癌旁正常组织21例作为对照。采用免疫组织化学染色及免疫印迹方法定性、定量检测pULK、PI3KC3在NSCLC和癌旁正常肺组织中的表达情况，并采用SPSS 13.0统计软件进行病理因素及相关性分析。结果 免疫组化结果显示pULK和PI3KC3阳性表达定位于细胞质。pULK和PI3KC3在肺癌组中的阳性表达（35.1%、40.3%）显著低于癌旁正常肺组织（81.0%、76.2%，P＜0.01）。NSCLC中无淋巴结转移、TNM分期的Ⅰ～Ⅱ期和中高分化患者的pULK和PI3KC3蛋白表达阳性率均较高（P＜0.01），而不同年龄、性别、肿瘤直径大小的NSCLC的表达差异无统计学意义。相关性分析显示pULK与PI3KC3表达呈正相关关系。结论 pULK、PI3KC3在NSCLC中呈低表达。其表达与患者的临床分期、分化程度及淋巴结转移有关，而与患者年龄、性别、肿瘤组织学类型及大小无关。

自噬；磷酸转移酶类（醇族体）；癌，非小细胞肺；自噬相关蛋白1；Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌总数的80%，症状较隐匿，易复发，因此该病的预防和早期诊断尤为重要［1-2］。细胞自噬（autophagy）的形成与自噬相关基因（autophagy related gene，Atg）有关［3-4］。目前关于肺癌中自噬相关蛋白1（autophagy related protein 1，pULK）、调控因子Ⅲ型磷脂酰肌醇 3激酶（phosphoinositide-3-kinase class 3，PI3KC3）的表达情况还不清楚。本研究通过检测NSCLC标本中自噬相关基因pULK、PI3KC3的表达情况，探讨NSCLC中自噬相关基因的变化趋势及可能的调控机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机抽取2013年1月—2014年10月辽宁医学院附属第一医院手术切除的具有完整临床及病理资料的NSCLC患者77例（肺癌组），所有患者均经病理学检查确诊。77例患者中，男39例，女38例，年龄36～74岁，平均（56±9）岁。所有病例均经病理证实，术前未经过放化疗。按照国际抗癌联盟2009年修订的TNM分期标准：Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期45例。按照WHO肺癌分类标准：鳞癌31例，腺癌31例，大细胞未分化癌15例；中、高分化34例，低分化43例。瘤体直径＜3 cm者47例，≥3 cm者30例；无淋巴结转移33例，有淋巴结转移44例。另收集部分患者距癌组织＞5 cm、经HE染色证实无癌细胞浸润的正常余肺组织21例（正常组）。所有标本的使用均经我院医学伦理委员会同意，取得患者或家属的知情。

1.2 主要试剂及仪器 兔抗人pULK购自北京博奥森生物公司，PI3KC3单克隆抗体、normal rabbit IgG购自美国ABGENT公司。PV6001辣根酶标记羊抗兔二抗试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。石蜡切片机、摊片烤片机（德国莱卡公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化染色及分析 手术切除后的标本迅速经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，厚度5 μm切片。采用免疫组化Envision二步法进行检测。切片常规脱蜡至水，将切片置于含pH 6.0枸椽酸缓冲液的高压锅内，加热至减压阀喷气2 min以修复抗原，自然冷却后，PBS洗涤；3%过氧化氢溶液处理10～30 min以去除内源性过氧化物酶；滴加适当浓度稀释的一抗（兔抗人pULK抗体），4℃孵育过夜；滴加聚合物辅助剂，37℃孵育30 min；滴加辣根酶标记羊抗兔IgG多聚体（PV6001）37℃孵育30 min，以上各步骤间均采用0.01 mol/L PBS洗涤3次，每次5 min；DAB显色；苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。同型对照采用normal rabbit IgG替代一抗。PI3KC3蛋白染色步骤同上。

采用Greenspan半定量法对阳性细胞比例及染色强度进行评分。阳性细胞比例及染色强度均分为1～4共4个级别，对应的阳性细胞数量分别为≤10%、11%～25%、26%～50%、≥51%，对应的染色强度分别为无着色、淡棕黄色、棕黄色、深棕色。两者评分相乘，≤2分者为阴性，＞2分者为阳性。

1.3.2 免疫印迹 收集同期手术切除的肺癌组织和癌旁正常肺组织标本，加入细胞裂解液，采用超声粉碎仪进行粉碎，离心取上清液。采用2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠法测定蛋白含量后，制备肺组织蛋白样品。上样，电泳，转膜、半干转印，TBS-T漂洗后，采用5%血清白蛋白于室温下封闭1～2 h。分别加入兔抗人pULK（1∶500稀释）、PI3KC3（1∶1 000稀释）抗体，于4℃层析冷柜内震荡孵育过夜，TBS-T液漂洗3次，每次约10 min；滴加1∶200稀释的辣根酶标记的羊抗兔IgG抗体，室温孵育1～2 h，TBS-T缓冲液漂洗3次，每次约10 min；然后采用增强化学发光（Electro chemiluminescence，ECL）化学发光法显色，内参采用β-肌动蛋白（β-Actin蛋白）进行对照。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，多重比较采用LSD-t法，计数资料组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Bivariate（Spearman）等级相关性分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 pULK和PI3KC3在肺癌和正常肺组织的表达情况

2.1.1 免疫组化结果 pULK和PI3KC3阳性表达均定位于细胞质。两者在肺癌组的阳性表达率低于正常组（P＜0.01）。pULK和PI3KC3在鳞癌、腺癌、大细胞未分化癌中的阳性表达率差异无统计学意义（P＞0.05），见表1，图1、2。

Tab.1 Expression of pULK and PI3KC3 in human peri tumor normal lung tissue and non-small cell lung cancer表1 pULK、PI3KC3在癌旁正常肺组织与非小细胞肺癌表达的情况 例（%）

2.1.2 免疫印迹结果 pULK和PI3KC3在鳞癌、腺癌、大细胞未分化癌中的相对表达率低于正常组（P＜0.05），但NSCLC 3组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2、图3。

Tab.2 Comparison of expression levels of pULK and PI3KC3 in different types of NSCLC表2 pULK、PI3KC3在不同类型非小细胞肺癌表达水平比较 （%，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of pULK and PI3KC3 in different types of NSCLC表2 pULK、PI3KC3在不同类型非小细胞肺癌表达水平比较 （%，±s）

a与正常组比较P＜0.05

组别正常组鳞癌腺癌大细胞未分化癌F n5555 pULK 76.91±10.19 36.60±3.11a41.83±5.07a34.39±4.23a30.238＊＊PI3KC3 75.33±7.93 25.26±5.98a30.79±3.22a24.10±2.13a63.294＊＊

Fig.3 Comparison of expression levels of pULK and PI3KC3 in different types of NSCLC by Western blot图3 pULK、PI3KC3在不同类型NSCLC表达情况比较条带

2.2 不同临床病理特征NSCLC患者中pULK和PI3KC3蛋白阳性表达的情况 NSCLC中无淋巴结转移、TNM分期的Ⅰ～Ⅱ期和中高分化患者的pULK和 PI3KC3蛋白表达阳性率均较高（P＜0.01），而不同年龄、性别、肿瘤直径大小的NSCLC的表达差异无统计学意义，见表3。

Tab.3 Expression of pULK and PI3KC3 in different subgroups of NSCLC表3 pULK、PI3KC3在NSCLC中的表达情况例（%）

2.3 自噬相关蛋白表达的相关性 相关性分析结果显示，NSCLC组织中，pULK与PI3KC3表达呈正相关关系，见表4。

Tab.4 Correlation analysis of pULK and PI3KC3 in NSCLC表4 非小细胞肺癌中pULK、PI3KC3表达的相关性（例）

3 讨论

自噬的形成分为诱导、启动、延长和成熟4个阶段［5-6］。pULK主要参与自噬的诱导阶段，其活性受到mTOR的调控；Atg6/Bclcin1主要参与自噬的起始阶段。PI3KC3是Ⅲ型PI3K，即酵母Vsp34的同源蛋白，在进化上非常保守，仅具有PI3K核心结构，催化亚基Vsp34与Atg6/Bclcin1的保守结构域（ECD）结合，催化质膜的磷脂酰肌醇生成磷脂酰肌醇三磷酸，磷脂酰肌醇三磷酸募集含有其结合域的分子到细胞内膜，并促进自噬相关蛋白Atg21、Atg24等结合到膜上，形成自噬前体结构（PAS）。而自噬的延伸阶段主要由许多Atg因子调节参与［7-8］。一方面，Atg12与Atg5、Atg16形成复合体结合到PAS上；另一方面，Atg8/LC3分别在Atg7和Atg3两种酶的作用下共价连接到磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）上形成LC3-Ⅱ-PE复合体，此复合体再结合到质膜上参与PAS的延伸。最后，自噬体通过与溶酶体融合形成成熟的自噬体，即自噬溶酶体。在其作用下，自噬体膜及其包裹物发生降解［9］。

王文涛等［10］采取免疫组织化学SP法检测72例NSCLC标本中Beclin1、LC3的表达情况，发现Beclin1在NSCLC的表达与患者的年龄及临床分期有关，而LC3在NSCLC的表达与患者的临床分期和肿瘤分化程度有关；且Beclin1、LC3在NSCLC中的表达呈正相关。此结果提示Beclin1、LC3在NSCLC中低表达，自噬活性的降低可能对肺癌的发生发展及侵袭转移起一定的作用。Cooper等［11-12］发现mTOR在NSCLC中的激活对NSCLC发生、发展中起到一定的作用，有望作为抗肿瘤治疗的有效新靶点。

本研究在以上文献基础上，进一步检测肺癌中自噬诱导阶段的主要因子pULK、起始阶段的调控因子PI3KC3的表达情况。结果提示自噬活性的下降在 NSCLC的发生发展中可能起一定作用。NSCLC组织中的临床病理因素分析显示，pULK和PI3KC3蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤直径大小无关。但在NSCLC早期，未见淋巴结转移或者是分化程度高的组织中呈现较高的表达趋势，并且两者表达呈现正相关。pULK和PI3KC3的高表达提示肺癌自噬活性较高，推测NSCLC早期可能通过细胞自噬来发挥抑制肿瘤发生及发展的效应。而在肺癌晚期，发生淋巴结转移或是分化程度较低时，pULK 和PI3KC3呈现表达减弱的趋势，两者在NSCLC中的表达减弱提示自噬活性的下降，并且可能与肿瘤发展和预后不良有关。目前，肿瘤自噬的调控机制尚不完全清楚，随着研究的进一步深入，必将明确其在NSCLC中发生、发展的作用，促进NSCLC发生机制的阐明，为NSCLC的防治提供新策略，为新药的开发提供可靠的理论和实验依据。

（图1、2见插页）

［1］Kalemkerian GP.Advances in pharmacotherapy of small cell lung cancer［J］.Expert Opin Pharmacother，2014，15（16）:2385-2396.doi: 10.1517/14656566.2014.957180.

［2］Blais N，Kassouf E.Maintenance therapies for non-small cell lung cancer［J］.Front Oncol，2014，19（4）:213.doi:10.3389/fonc.2014.00213.

［3］Thorburn A，Thamm DH，Gustafson DL.Autophagy and cancer therapy ［J］.Mol Pharmacol，2014，85（6）:830-838.doi:10.1124/mol.114.091850.

［4］Sun YJ，Guo QL.Research Progress of Autophagy［J］.Pharmaceutical and Clinical Research，2012，20（3）:236-239［孙雅婧，郭青龙.细胞自噬的研究进展［J］.药学与临床研究，2012，20（3）:236-239］.doi:10.3969/j.issn.1673-7806.2012.03.015.

［5］Kenific CM，Debnath J.Cellular and metabolic functions for autophagy in cancer cells［J］.Trends Cell Biol，2015，25（1）:37-45.doi: 10.1016/j.tcb.

［6］Lorin S，Hamaï A，Mehrpour M，et al.Autophagy regulation and its role in cancer［J］.Semin Cancer Biol，2013，23（5）:361-379.doi: 10.1016/j.semcancer.2013.06.007.

［7］Hung CM，Garcia-Haro L，Sparks CA，et al.mTOR-dependent cell survival mechanisms［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2012，4 （12）：pii:a008771.doi:10.1101/cshperspect.a008771.

［8］WU P，XU CM.Advances in Relationship Between ClassⅢPI3K Complex and Autophagy［J］.Prog Biochem Biophys，2012，39（3）: 210-216.［吴葩，许彩民.Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶复合物与自噬的研究进展［J］.生物化学与生物物理进展，2012，39（3）:210-216］.doi:10.3760/j.issn.1674-1935.2011.06.012.

［9］Nam HY，Han MW，Chang HW，et al.Prolonged autophagy by MTOR inhibitor leads radioresistant cancer cells into senescence［J］.Autophagy，2013，9（10）:1631-1632.doi:10.4161/auto.25879.

［10］Wang WT，Zhao S.Expression and significance of Beclinl and LC3 in non-small cell lung cancer［J］.Chinese Journal of Gerontology，2012，32（10）:2055-2057.［王文涛，赵松.Beclin 1、LC3在非小细胞肺癌中的表达水平及意义［J］.中国老年学杂志，2012，32（10）: 2055-2057］.doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2012.10.027.

［11］Cooper WA，Lam DC，O'Toole SA，et al.Molecular biology of lung cancer［J］.J Thorac Dis，2013，10（5）Suppl 5:S479-490.doi:10.3978/ j.issn.2072-1439.2013.08.03.

［12］Forde PM，Ettinger DS.Targeted therapy for non-small-cell lung cancer:past，present and future［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2013，13（6）:745-758.doi:10.1586/era.13.47.

（2014-08-26收稿 2015-01-09修回）

（本文编辑 魏杰）

Expression autophagy-related gene pULK and PI3KC3 and their correlation with human nonsmall-cell carcinoma

WU Nan1，MIN Heming2，QU Huiying1，BAO Cuifen2△
1 Department of Human Anatomy&Histology and Embryology，2 Key lab of Molecular Cell Biology and New Drug Development，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China
△Corresponding Author E-mail：mianyizuhua@aliyun.com

Objective To examine expression levels of autophagy gene pULK and PI3KC3 and to explore their correlation with non-small cell lung cancer（NSCLC）.Methods A total of 77 samples of surgical resection from NSCLC speci-mens（including 31 cases of squamous cell carcinoma，31 cases of adenocarcinoma and 15 cases of large cell undifferentiated carcinoma）and 21 samples of same normal lung tissue were randomly selected.Expressions of pULK and PI3KC3 in lung tissues were assessed by immunohistochemistry and Western blot.All dates were analyzed using SPSS13.0 statistical package.Results Immunohistochemistry indicated that pULK and PI3KC3 localized into the cytoplasm.The expression levels of pULK and PI3KC3 are significantly lower in patient with NSCLC than those in peri-tumor tissue（35.1%vs 81.0%，40.3% vs 76.2%respectively，P＜0.01）.Immunohistochemistry and Western bolt analysis confirmed that pULK and PI3KC3 expressions were significantly down-regulated（P＜0.01）in patients with low grade cellular differentiation，metastasis of lymph node，or stageⅢandⅣ.And expression levels of pULK and PI3KC3 in NSCLC did not differ significantly with ages，gender，tumor size and pathological type.Correlation analysis showed that the expression of PI3KC3 was positively correlated with pULK.Conclusion pULK and PI3KC3 expressions were lower in NSCLC than those in normal lung tissue group.The expression levels of pULK and PI3KC3 in NSCLC were correlated with patient's clinical stage，differentiation grade，lymph node metastasis but were unrelated with age，gender，histological type and size.

autophagy；phosphotransferases（alcohol group acceptor）；carcinoma，non-small-cell lung；autophagy related protein 1；phosphoinositide-3-kinase class 3

R734.2

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.015

辽宁省科技厅基金资助项目（201302143）

1锦州，辽宁医学院人体解剖教研室（邮编121000），2分子细胞生物与新药开发省高校重点实验室

吴楠（1982），女，硕士在读，主要从事肺癌发病机制方面研究

△E-mail：mianyizuhua@aliyun.com